天麻與鉤藤配伍前后天麻素在SHR大鼠肝臟和腎臟的分布與歸經探討Δ

李 瑩，李曉倩，王 興，辛 秀，張衛國，王敏智（西南交通大學生命科學與工程學院，成都市 610031）

天麻是蘭科植物天麻Gastrodia elata BL.的干燥塊莖，性甘、味平，歸肝經，為治療肝陽上亢、肝風內動的要藥。天麻中含有天麻素、異天麻素、香莢蘭醇、香莢蘭醛、天麻多糖等成分[1]。本研究通過測定天麻與鉤藤配伍前后效應成分天麻素（Gastrodin）在SHR大鼠肝臟、腎臟的分布，討論藥對配伍作用對天麻素在大鼠體內分布過程的影響，初步探討天麻的歸經理論和藥對配伍在歸經中的意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津儀器有限公司）；TU-1901型雙光束紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器責任有限公司）；MTN-2800W型氮吹濃縮裝置（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 試藥

天麻、鉤藤購自四川新荷花飲片公司，經西南交通大學生命科學與工程學院宋良科副教授鑒定為真品；天麻素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110807-200205）；間苯三酚（北京化學試劑公司，批號：040401）；甲醇、乙腈（天津市科密歐化學試劑有限公司，色譜純）；其余試劑為分析純。

1.3 動物

14周齡SHR大鼠65只，♂，體重（270±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司（動物生產許可證號：SCXK（滬）2008-0005）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenence Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-1%磷酸（3∶97）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：220 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取減壓干燥后的天麻素對照品適量，加甲醇溶解并稀釋成濃度為0.2 g·mL-1的天麻素對照品貯備溶液，備用。

2.2.2 內標溶液的制備 精密稱取減壓干燥后的內標間苯三酚適量，加甲醇溶解并稀釋成濃度為0.4 g·mL-1的內標溶液，備用。

2.3 分組與給藥

將65只SHR大鼠按體重隨機分為3組，即對照（等容生理鹽水）、天麻（0.95 g·kg-1）、天麻鉤藤（2.2 g·kg-1）組。其中對照組5只，天麻組和天麻鉤藤組分別按時間點細分為6個時間組，即15、30、60、120、180、240 min組，每組5只。制備0.1 g·mL-1的天麻混懸液、0.2 g·mL-1（天麻∶鉤藤＝3∶4）的共煎液。按照陳奇主編的《中藥藥理學方法》中的給藥量ig給藥。大鼠日給藥劑量＝人日給藥劑量×6.17×校正系數。其中，校正系數為大鼠實際體重與大鼠標準體重的比值。

2.4 樣品預處理

稱取大鼠肝臟與腎臟組織，置于勻漿器中，加入2.5倍生理鹽水，勻漿，3 000 r·min-1離心10 min，取上清液。精密吸取250 μL勻漿液，加8倍量甲醇和50 μL內標間苯三酚，渦旋混勻30 s，3 000 r·min-1離心5 min，取上清液，60 ℃水浴下氮吹干，100 μL 雙蒸水復溶，靜置 12 h，渦旋，10 000 r·min-1離心 10 min，取上清液，即得[2，3]。

2.5 標準曲線的制備

在8支塑料離心試管中，分別精密加入250 μL肝臟組織空白勻漿，再各加入50 μL內標溶液，將標準工作液配制成天麻素系列濃度分別為 200、50、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 μg·mL-1的樣品。按“2.4”項下方法預處理樣品，分別吸取10 μL進樣。以樣品濃度（X）為橫坐標，樣品峰面積與內標峰面積之比（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得天麻素在肝臟中的回歸方程為Y＝0.008 2X－0.000 7（r＝0.999 5）；天麻素在腎臟中的回歸方程為Y＝0.010 9X－0.001 6（r＝0.999 9）。結果表明，天麻素的檢測濃度在0.312 5～200 μg·mL-1范圍內同其峰面積與內標峰面積之比線性關系良好。

2.6 精密度與回收率試驗

精密吸取250 μL大鼠肝臟、腎臟空白組織勻漿置于塑料離心管中，分別加入天麻素對照品貯備液適量，制成低、中、高濃度的樣品液，肝臟為0.625、5、50 μg·mL-1，腎臟為0.625、5、40 μg·mL-1，按“2.4”項下方法預處理樣品，并按“2.1”項下色譜條件測定，計算得濃度A。上述處理得到的樣品分別在24 h內每隔6 h測定1次，求算日內精密度；并在連續4 d內每天測定1次，求算日間精密度。精密度試驗結果見表1、表2。

精密吸取250 μL流動相，加入天麻素對照品貯備液適量，配制上述低、中、高濃度樣品液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算得濃度B。濃度B與加入量真實值之比為方法回收率；濃度A與濃度B之比為提取回收率。回收率試驗結果見表1、表2。

表1 肝臟樣品的回收率和精密度試驗結果Tab 1 Precision and recovery of liver tissue

表2 腎臟樣品的回收率和精密度試驗結果Tab 2 Precision and recovery of kidney tissue

2.7 穩定性試驗

精密配制天麻素低、中、高濃度的肝勻漿（0.625、5、50 μg·mL-1）和腎勻漿（0.625、5、40 μg·mL-1）樣品，置于－20 ℃冰箱30 d后，按“2.4”項下方法預處理，測得天麻素含量的RSD均＜5.7%；配制同樣樣品，置于－20℃冰箱保存24 h后室溫解凍1 h，取出少量測定天麻素含量，其余繼續－20℃冰箱保存24 h，反復凍融3次，測得天麻素含量的RSD均＜10%。可見，天麻素在肝、腎組織樣品中有良好穩定性。

2.8 重復性試驗

取同一份組織勻漿樣品重復進樣6次，測定天麻素含量，得RSD＝1.4%，表明該方法有良好重復性。

2.9 組織分布實驗

將分組的SHR大鼠分別在末次給藥的15、30、60、120、180、240 min，經股動脈及斷頭放血后，取出肝臟和腎臟制備勻漿液樣品并進樣測定。各時間點組織中的天麻素含量見表3。

表3 各時間點組織中的天麻素含量（mg·g-1）Tab 3 Content of gastrodin in tissue for each time point（mg·g-1）

配伍前后肝臟、腎臟的2組數據分別用SPSS17.0軟件進行t檢驗，討論是否有顯著性差異。配伍前后顯著性差異分析見表4。

表4 配伍前后顯著性差異分析Tab 4 Analysis of significant difference before and after compatibility of G.elata and Uncariae Ramulus Cum Uncis Uncariae

由表4可見，肝臟、腎臟中配伍前后2組數據用t檢驗分析，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

研究結果表明，SHR大鼠ig天麻混懸液后，效應成分天麻素在腎臟內的最高血藥濃度（Cmax）高于肝臟。這與文獻[4]報道中使用放射自顯影方法所測定的結果基本一致。但是在給予天麻鉤藤水煎液后，效應成分的組織分布情況卻出現了逆轉。這說明并不能單純地以使用單味藥物時某些時間點中藥有效成分在體內的選擇性分布來論證中藥的歸經理論，還需從其與藥物的配伍使用等方面來綜合考慮。

根據數據顯示，天麻與鉤藤配伍后，天麻素在肝臟中Cmax增大，分布速率加快，消除速率加快；在腎臟中Cmax減小，消除速率減慢。綜上結果，推論鉤藤對天麻歸肝經可能有協同增強作用。這與天麻鉤藤飲方解中的天麻、鉤藤共為君藥，配伍使用以達平肝熄風之療效[5]相一致。

研究數據顯示，SHR大鼠ig天麻混懸液后，天麻素在肝臟的分布出現雙峰，而在腎臟中并未出現此情況。據文獻報道，某些采用正常大鼠血漿為對象進行的天麻素藥動學研究中血漿濃度也出現了二次達峰的現象[4]，據此推斷天麻素在大鼠體內的藥動學過程可能存在“肝腸循環”的情況，本研究中肝臟二次達峰的現象可能與之有關。但是在已有的文獻報道中，天麻素是否在大鼠體內存在肝腸循環還存在爭議，故此具體的原因還需進一步進行論證。

數據顯示，SHR大鼠ig天麻混懸液后，肝臟在180 min出現二次達峰，而天麻與鉤藤配伍后雙峰現象消失。這是否說明天麻與鉤藤的配伍使用影響了天麻素的肝腸循環還有待于進一步的研究論證。

由本研究可知，天麻與鉤藤的配伍使用對天麻中的效應成分天麻素在SHR大鼠體內的分布有較大影響，明顯改變了天麻素的藥動學過程。但是，產生這種影響的原因是否由于天麻、鉤藤的配伍對天麻歸肝經有協同加強的作用，還有待于通過其他大量的研究證實。

[1] 康延國.中藥鑒定學[M].北京：中國中醫藥出版社，2005：237.

[2] 王 興，胡瑞娟，黃 熙，等.RP-HPLC測定大鼠服用大川芎丸提取物后血漿中的天麻素[J].華西藥學雜志，2003，18（5）：341.

[3] 程 剛，郝秀華，劉國良，等.天麻素在大鼠體內的藥動學研究[J].中國藥學雜志，2003，38（2）：128.

[4] 陸光偉，鄒元杰，莫啟忠.3H-天麻素在大鼠體內的吸收分布、代謝和排泄[J].藥學學報，1985，20（3）：167.

[5] 段富津.方劑學[M].上海：上海科學技術出版社，2005：225.