異噻唑啉酮類化合物對三角褐指藻的抑制效應

楊翠云,夏傳海,劉蘇靜,周世偉 (中國科學院煙臺海岸帶研究所,山東 煙臺 264003)

海洋生物污損是指海洋微生物、植物和動物附著在海洋人工設施上造成的危害.藻類是海洋生態系統中的重要初級生產者,是形成污損生物的基礎.此外,近年來頻繁暴發的赤潮的起因也往往與藻類增殖密切相關.三角褐指藻即是一種常見的赤潮藻類,為保證海洋生態系統的可持續發展,開發具有抑制微藻生長的防污劑勢在必行.

異噻唑啉酮類化合物是指含有異噻唑啉酮環的系列化合物的總稱,是一種較新的有機除藻劑. 其對真菌、細菌、藻類均有較強的殺滅性,具低毒、高效和在水中易降解的特點[1-2].被廣泛應用于殺菌、調節植物生長、海洋防污等領域[3-5].值得關注的是,該類化合物對于海洋赤潮的防治也有明顯效果[6-7].基于此,作者選取三角褐指藻為模式藻種,研究異噻唑啉酮類化合物 BIT(1,2-苯并異噻唑啉-3-酮)及其類似物 X(N-丙酰基-1,2-苯并異噻唑啉-3-酮)對三角褐指藻生長的抑制效應,比較其對藻類的抗污效果,以期為防污劑的研制開發提供一定的理論基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用藻株三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)來自中國科學院海洋研究所. 海水取自天然海水,經脫脂棉過濾后,再用 0.45μm 醋酸纖維濾膜過濾,121℃高溫高壓滅菌20min后用作藻類培養.在三角玻璃瓶中,添加 f/2配方的營養鹽,光照強度 50μE/(m2?s),光暗比(L/D)=12h/12h,溫度(20±1)℃條件下在恒溫光照培養箱中進行培養,培養瓶每天定時搖動1次,防止貼壁生長.BIT(1,2-苯并異噻唑啉-3-酮)及其類似物 X(N-丙酰基-1,2-苯并異噻唑啉酮-3-酮),純度均達到95%以上,可用于一般的毒理學試驗.

1.2 方法

1.2.1 抑藻試驗 取對數生長期的三角褐指藻接種于 100mL 三角瓶中,使藻密度為1×105～2×105個/mL,加入BIT,使其終濃度分別為:0,0.5,1,1.5,2,2.5,3.0mg/L,每處理設3個平行.對X設同樣濃度處理,每處理設3個平行.每天取樣顯微鏡下計數藻細胞密度,并根據藻細胞密度計算藻細胞比生長速率,以及取樣第2d和第4d的藻細胞密度比,并選取產生最大抑制效應的第4d的藻細胞密度比,進行 Logistic 曲線方程擬合,計算BIT和X的EC50值.每2d取樣測定藻細胞內葉綠素及類胡蘿卜素含量.

1.2.2 藻細胞密度、細胞比生長速率、細胞密度比計算 藻細胞密度計數：每天定時取出1mL均勻的培養液,用 5%甲醛固定,并在顯微鏡下用血球計數板計數藻細胞數量的變化.平行計數3～5 次,取平均值.

藻細胞比生長速率計算:根據藻細胞密度,依照公式 (1) 計算藻細胞比生長速率[8].

式中:μ為比生長速率,d-1;Nt1為藻細胞在 t1時刻的密度;Nt2為藻細胞在t2時刻的密度;△t為2次測定之間的時間間隔,d.藻細胞密度比計算:根據每天取樣計數的藻細胞密度計算.藻細胞密度比=處理組藻細胞密度/空白組藻細胞密度.

1.2.3 葉綠素和類胡蘿卜素含量測定 每2d取5mL藻液 4000r/min離心 5min,棄去上清液,用95%的乙醇重新懸浮沉淀,并于 4℃冰箱提取葉綠素和類胡蘿卜素.24h后,4000r/min離心5min,取上清液在紫外/可見分光光度計(UV-1810,北京普析通用儀器有限責任公司)上,于波長665,649,470nm 處測上清液的吸光度.根據Lichtenthaler和Buschmann提出的公式計算葉綠素和類胡蘿卜素含量[8]:

式中: A為吸光值(波長665, 649, 470nm處), Chla為葉綠素a.

1.3 數據統計

數據采用origin 7.0軟件進行差異顯著性分析,P＜0.01表示差異極顯著.應用 SigmaPlot for Windows Version 10.0(Systat Software Inc., USA)進行曲線方程擬合及EC50的計算.

2 結果與討論

2.1 BIT及其類似物X對三角褐指藻生長的影響

由圖1可見,2mg/L和3mg/L BIT處理對三角褐指藻具有明顯的抑制作用,且在生長第4d,抑制率顯著,分別為51.29%、84.76%.而0.5mg/L和1mg/LBIT處理下,細胞生長曲線與對照無明顯差別,說明低濃度BIT對藻細胞生長基本沒有影響.2mg/L和3mg/L的X處理對三角褐指藻具有一定的抑制作用,最明顯的抑制率發生在生長第3d,分別為36.24%、45.01%.相同濃度處理下X沒有BIT 的抑制作用明顯,低濃度的X處理同樣對三角褐指藻的生長沒有明顯的抑制作用.但無論是低濃度處理組還是高濃度處理組,藻細胞密度均隨時間的延長而逐漸增加.總體來看,BIT或X的處理只是延長了藻細胞的延滯生長期,且處理濃度越高,效果越明顯;但隨著時間的延長,這種作用也越來越弱,處理組和對照組,藻細胞生長曲線均呈逐漸上升的趨勢,這與文獻報道的很多外源性物質對藻類的脅迫作用相似[9-11].研究表明,鼠李糖等表面活性劑或殺藻劑對多種海洋藻類包括中肋骨條藻、新月菱形藻、旋鏈角毛藻等具有一定的抑制效應,但隨著處理時間延長,處理組藻細胞密度均呈快速增值趨勢,藻細胞生長的延滯期長短取決于外源性物質的濃度高低.本實驗中同時發現,在高濃度BIT處理下,最初培養液中會出現白色沉淀,顯微鏡觀察推測可能是藻細胞死亡的殘體,未死亡的藻細胞經過一段時間適應之后逐漸增殖,使其度過外源性化合物的脅迫期,呈現從被動適應到主動適應的過程.

圖1 不同濃度BIT和X處理對三角褐指藻生長的影響Fig.1 Effect of BIT and X on the growth of Phaeodactylum tricornutum

細胞比生長速率與藻細胞密度比可以進一步評價外源性物質對藻細胞生長的影響.從圖2可以看出,3mg/L的BIT處理組,藻細胞比生長速率顯著低于對照組(P＜0.01),說明高濃度 BIT處理能顯著抑制藻細胞的生長;2mg/L的BIT處理,藻細胞比生長速率略微低于對照,但經統計檢驗沒有達到顯著水平;而低濃度(0.5,1mg/L)BIT處理,細胞比生長速率與對照幾乎沒有差異.同樣,X的低濃度處理組(0.5,1mg/L)細胞比生長速率和對照也無明顯差異,而高濃度X處理組(2,3mg/L),細胞比生長速率低于對照,說明高濃度的X處理能夠抑制藻細胞的生長,但這種抑制作用沒有達到顯著水平.

圖2 不同濃度BIT和X處理對三角褐指藻細胞比生長速率的影響Fig.2 Effects of BIT and X on the specific growth rate of Phaeodactylum tricornutum

同樣,選取第2d和第4d的藻細胞密度比來評價BIT和X對三角褐指藻生長的抑制效應,圖3可以看出,隨著BIT處理濃度的增加,培養第2d和第4d的藻細胞密度比明顯降低,并且在3mg/L的處理濃度下,第4d的藻細胞密度比顯著低于第2d的藻細胞密度比,說明高濃度的BIT能顯著抑制藻細胞的生長. X對三角褐指藻的處理第2d和第4d的藻細胞密度比同樣隨處理濃度的升高而顯著下降(P＜0.01),但第2d和第4d相比藻細胞密度比沒有顯著差異,說明高濃度X的處理沒有隨時間的延長表現出對三角褐指藻有更明顯的抑制效應.藻細胞密度比對BIT和X的響應正好和藻細胞的比生長速率相對應,高濃度的BIT顯著抑制藻細胞的生長而X對藻細胞的生長具有一定的抑制效應但均沒有達到顯著水平.

圖3 不同濃度BIT和X處理對三角褐指藻細胞密度比的影響Fig.3 Effects of BIT and X on the cell density ratio of Phaeodactylum tricornutum

選取最大抑制(接種4d)時的樣品,探討 BIT和X對三角褐指藻生長的抑制效應.以對照中三角褐指藻密度為100%,計算各提取液處理下三角褐指藻相對密度,得到提取液對三角褐指藻生長的抑制曲線(圖4).運用Logistic曲線方程擬合,即可獲得BIT和X的96h半效應質量濃度(EC50)分別為1.95mg/L(R2=0.988, P=0.0013)和3.26mg/L(R2=0.908, P=0.0279). EC50值的差異進一步證實BIT對三角褐指藻的抑制作用比X對藻的抑制作用強.除本實驗研究的三角褐指藻之外,國內江濤等[12]研究也發現,異噻唑啉酮對湛江球形棕囊藻、海洋單細胞藻和棕櫚藻均有較強的殺滅作用.而Willingham 等[13]指出,異噻唑啉酮類似物 Sea-Nine211防污劑對Enteromorpha藻和硅藻 Amphora coffeaeformis具有較強的殺滅作用,半數致死量LD50分別為0.002mg/L和0.003mg/L,遠遠低于本研究的EC50值,這可能是由于外源性化合物對藻類的脅迫效應具有種類特異性[9],并且和實驗初期藻細胞起始密度具有一定關系.Hong等[14]曾報道,EMA(2-甲基-乙酰乙酸乙酯)對綠藻 Selenastrum capricornutum的生長、生理脅迫反應和藻細胞的初始密度密切相關.同樣的結果也出現在其他文獻[15-16]報道中,藻類的起始密度或藻類的不同生長期加入外源性物質,藻類受到的脅迫反應大小不同,或者說恢復正常生長達到對數期的時間不同.

圖4 不同濃度BIT和X處理對三角褐指藻的抑制效應Fig.4 Inhibitory effect of BIT and X on Phaeodactylum tricornutum

2.2 BIT及其類似物X對三角褐指藻細胞色素含量的影響

藻細胞色素含量是藻類生長特征的表征參數,是藻生物量的一種反映,同時也是藻進行生長光合作用的重要物質基礎,色素含量可以反映藻類生長狀況和藻類的光合作用利用效率[17].由圖5可見,三角褐指藻生長 3d時,低濃度0.5mg/L的BIT對藻細胞內葉綠素和類胡蘿卜素含量均沒有明顯影響;而1mg/L的BIT處理3d顯著降低了細胞內葉綠素含量(P＜0.01)和類胡蘿卜素含量(P＜0.05),分別降低了 21.85%和21.09%;高濃度 BIT(2mg/L 和3mg/L)處理 3d,細胞內葉綠素分別降低53.09%、88.91%,類胡蘿卜素含量分別降低54.42%、90.02%,均達到極顯著水平(P＜0.01).藻細胞經過處理7d時,只有3mg/L的BIT處理組細胞內葉綠素和類胡蘿卜素含量顯著低于對照(P＜0.05),分別降低53.8%、58.71%,而其他處理組和對照相比均沒有明顯變化,說明隨著處理時間的延長BIT引起的藻細胞的脅迫效應逐漸減弱,這和藻細胞生長抑制曲線結果類似.隨著時間的延長,藻細胞生長密度逐漸增加,恢復生長.而X對藻細胞內色素含量的影響只有在高濃度3mg/L處理7d時細胞內葉綠素含量降低30.51% (P＜0.01),而類胡蘿卜色素含量在處理3d、7d時均顯著降低,分別降低 51.18%、31.04%.BIT和X對藻細胞內色素含量的影響結果顯示,異噻唑啉酮類化合物能夠抑制藻細胞內色素含量,進而影響藻細胞的光合作用效率,影響藻的生長.以前的研究報道表明,外源性物質對藻的抑制機理主要在4個方面:破壞藻細胞結構,改變藻的光合、呼吸以及細胞內酶的活性.Yang等[16]報道外源性物質EMA能誘導細胞內一系列酶和非酶物質的改變抵抗外界脅迫,并發現 EMA能抑制細胞內色素含量,改變色素比例,這可能是藻類適應逆境脅迫的策略.在本研究中,發現BIT和X能夠抑制藻細胞的色素含量,說明其光合作用受到抑制,但隨處理時間延長,抑制作用減弱.這說明:藻細胞數量的增加抵抗了脅迫,這和外源性物質對藻的抑制效應隨細胞起始密度增加而減弱相呼應[14,18].

圖5 不同濃度BIT和X處理對三角褐指藻細胞色素含量的影響Fig.5 Effects of BIT and X on the pigment contents of Phaeodactylum tricornutum

細胞色素含量的增加提高了藻的光合作用,而外源性物質的濃度只可能不變或減少,因此藻細胞逐漸適應并抵抗了外界脅迫.本研究同時確認, BIT比X具有更好的抑藻效果,具有更低的EC50值,在海洋防污劑開發中有更好的的應用前景.但在實際應用中,還應該考慮其在環境中的遷移轉化及其可能存在的生態安全性,防止類似于四丁基錫(TBT)類防污劑廣泛應用后帶來的生態災害問題發生,關于BIT對其它污損生物的防污效果及其環境歸宿還需要更進一步深入系統研究.

3 結論

3.1 異噻唑啉酮類化合物對三角褐指藻的生長、比生長速率、細胞密度比結果均顯示,BIT和X在高濃度下對三角褐指藻均具有一定的抑制效應,能增加藻細胞生長的延滯期,但這種抑制作用均會隨著處理時間的延長而減弱,藻細胞逐漸恢復快速增殖,BIT的抑制效應優于X.

3.2 BIT和X能夠降低三角褐指藻細胞內色素含量,BIT在處理3d時,較低濃度(1mg/L,2mg/L)和高濃度(3mg/L)均能降低細胞內葉綠素和類胡蘿卜素含量,但處理7d時只有高濃度能夠降低色素含量,而X在整個處理時間內只有高濃度能夠降低細胞色素含量.

3.3 BIT和X對藻的96h半效應質量濃度(EC50)分別為1.95mg/L(R2=0.988,P=0.0013)和3.26mg/L(R2=0.908, P=0.0279),EC50值的差異進一步說明BIT比X對三角褐指藻的抑制作用強.

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