VC磷酸酯的HPLC分析

張會輕，袁立國，王淑華，王云霞

（河北維爾康制藥有限公司，河北石家莊 050031）

VC磷酸酯的HPLC分析

張會輕，袁立國，王淑華，王云霞

（河北維爾康制藥有限公司，河北石家莊 050031）

建立了高效液相色譜法（HPLC）測定L－抗壞血酸－2－磷酸酯含量的分析方法。采用Agilent Eclipse XDB C18分析柱（250mm×4.0mm，5μm），以甲醇－0.1mol/L磷酸二氫鉀（pH 值為4.4）為流動相，二者體積比為35∶65，流速為1.0mL/min，檢測波長為254nm。在此色譜條件下，L－抗壞血酸－2－磷酸酯在0.01～0.10mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，樣品平均回收率為98.24%。

VC磷酸酯；高效液相色譜法；VC

VC 磷 酸 酯 （L－ascorbic acid－2－phosphate，APP）又名L－抗壞血酸－2－磷酸酯，是 VC的穩(wěn)定衍生物，是以VC為原料用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)加工而成的。VC磷酸酯耐受高溫、高壓、高濕等惡劣條件，其抵御飼料存貯過程中復(fù)雜環(huán)境的能力大大超過結(jié)晶VC和包膜VC。無論是在制粒過程中還是在調(diào)質(zhì)膨化過程中，L－抗壞血酸－2－磷酸酯的保存率都大于90%［1］。VC磷酸酯的主要構(gòu)成成分是VC和磷。VC磷酸酯具有VC的所有功效，又克服了VC易受光、熱、金屬離子等作用而氧化的缺點(diǎn)，因此在飼料中添加該產(chǎn)品不但不會改變飼料的質(zhì)量，而且可以增加飼料的營養(yǎng)價(jià)值，是水產(chǎn)養(yǎng)殖的優(yōu)選添加劑。但是，VC的化學(xué)活性高，不穩(wěn)定，極易被氧化分解，從而失去VC的功效，在高溫或光照下分解更快，在高溫的酸性介質(zhì)中容易脫水而失去活性［2－3］。與VC相比，VC磷酸酯具有下列優(yōu)點(diǎn)：1）化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不易氧化；2）對熱穩(wěn)定性高；3）生物利用度高，VC磷酸酯可以被生物體內(nèi)的磷酸酶分解，具有與VC相同的生物效價(jià)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

VC磷酸酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%，北京貝麗萊斯生物化學(xué)有限公司提供）；甲醇（色譜純）；純化水。

WATERS高效液相色譜儀，2487紫外檢測器。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18分析柱（250 mm×4.0mm，5μm）；流動相：甲醇－0.1mol/L磷酸二氫鉀（pH值為4.4，二者體積比為35∶65）；紫外測定波長為254nm；流速為1.0mL/min；進(jìn)樣20μL。

1.3 流動相配制

精密稱取13.609g（0.1mol）磷酸二氫鉀，用純化水溶解并定容至1L，用85%（體積分?jǐn)?shù)）磷酸調(diào)節(jié)pH值至4.4，即得0.1mol/L的磷酸二氫鉀溶液（pH值為4.4）。用有機(jī)膜過濾，超聲溶解20min，備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

采用流動相作為背景緩沖液，用二極管陣列檢測器對L－抗壞血酸－2－磷酸酯標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液在190～400nm進(jìn)行全波長紫外掃描。結(jié)果表明，L－抗壞血酸－2－磷酸酯在254nm處有最大吸收，且雜峰干擾少，本實(shí)驗(yàn)選擇檢測波長為254nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和檢出限

準(zhǔn)確稱取3－環(huán)己胺－抗壞血酸－2－磷酸酯（純度大于99.0%）標(biāo)準(zhǔn)品0.316g，用磷酸鹽緩沖溶液溶解并定容在100mL棕色容量瓶中。其中L－抗壞血酸質(zhì)量濃度為1.0mg/mL。分別移取上述溶液1.0，2.0，4.0，5.0，10.0mL，置于100mL棕色容量瓶中，用磷酸鹽緩沖溶液溶解并定容，配成0.01，0.02，0.04，0.05，0.10mg/mL（以L－抗壞血酸質(zhì)量濃度計(jì)）的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按1.2色譜條件測定，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線，見圖1。結(jié)果表明，線性范圍為0.01～0.10mg/mL時(shí)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y＝8 148.3X－14.092，R2＝0.999 9。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.1 Standard curve

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

配制質(zhì)量濃度為0.05mg/mL的VC磷酸酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次20μL，測定其峰面積，計(jì)算RSD值為0.113%。計(jì)算結(jié)果見表1。

表1 精密度結(jié)果Tab.1 Results of precision

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

配制質(zhì)量濃度為0.05mg/mL的VC磷酸酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在室溫下每隔2h測定一次溶液中VC磷酸酯的含量，計(jì)算RSD值為0.503%（見表2）。結(jié)果表明：VC磷酸酯在流動相溶液中6h內(nèi)是穩(wěn)定的。

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Tab.2 Test of stability

2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取已知含量試樣，向其中加入定量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行色譜分析測定，加樣回收率平均值為98.24%，計(jì)算結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率結(jié)果Tab.3 Results of recovery

2.6 樣品的測定

準(zhǔn)確稱取樣品0.020 0g，放入100mL棕色容量瓶內(nèi)，用流動相溶解，超聲時(shí)間為10min，用0.45 μm的濾膜過濾，按1.2色譜條件進(jìn)樣，用外標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算。由實(shí)驗(yàn)得知，標(biāo)準(zhǔn)品譜圖（見圖2）與色譜圖（見圖3）保留時(shí)間相一致。

圖2 L－抗壞血酸－2－磷酸酯標(biāo)準(zhǔn)品譜圖Fig.2 Chromatograms of standard of L－ascorbic acid－2－phosphate

圖3 L－抗壞血酸－2－磷酸酯樣品譜圖Fig.3 Chromatograms of sample of L－ascorbic acid－2－phosphate

［1］程 恩，宋國梁，路文江.高效價(jià)L－抗壞血酸－2－磷酸酯的穩(wěn)定性研究［J］.河北化工，2001（4）：19－20.

［2］CHARLES W D.Method of Preparation of Phosphate Ester of AscorbicAcid［P］.US：4179445，1979－06－02.

［3］CHEN L，SEIB P A，LIANG Y T，et al.Chemical synthesis of several phosphoric esters ofL－ascorbic acid［J］.Carbohydr Res，1978，67（1）：127－138.

HPLC analysis ofL－ascorbic acid－2－phosphate

ZHANG Hui－qing，YUAN Li－guo，WANG Shu－h(huán)ua，WANG Yun－xia
（Hebei Welcome Pharmaceutical Company Limited，Shijiazhuang Hebei 050031，China）

A phase high performance liquid chromatographic method has been developed for the determination ofL－ascorbic acid－2－phosphate.Agilent Eclipse XDB C18（250mm×4.0mm，5μm）column is used and the mobile phase is the mixture of methanol－0.1mol/L phosphoricacid two hydrogen potassium buffer solution（35︰65，V/V）.The flow rate is 1.0mL/min，and the detection wavelength is 254nm.The linear range is 0.01～0.10mg/mL，and the related coefficient is 0.999 9，the average recovery rate ofL－ascorbic acid－2－phosphate in the samples is 98.24%.

L－ascorbic acid－2－phosphate；HPLC；vitamin C

TQ443

A

1008－1534（2011）06－0364－02

2011－06－03；

2011－09－20

張士瑩

張會輕（1977－），女，河北石家莊人，工程師，主要從事藥物研發(fā)與分析方面的工作。