Livina特異性shRNA表達載體的構建與克隆的鑒定

(佳木斯大學基礎醫學院生物學教研室,黑龍江佳木斯154007)

Livina特異性shRNA表達載體的構建與克隆的鑒定

張春斌,饒冬梅,姜立松,劉 爽,張玉萍,江清林

(佳木斯大學基礎醫學院生物學教研室,黑龍江佳木斯154007)

目的:構建livina的shRNA表達載體,驗證livin靶向RNA干擾重組質粒是否構建成功并成功轉化入大腸桿菌。方法:用DNA重組技術將人livina基因及它對應的靶點shRNA克隆到表達載體pGenesil-1中,構建livina的shRNA表達載體,然后通過酶切電泳、測序對獲得的克隆進行鑒定。結果:經限制性酶切電泳及部分序列分析證明目的基因插入正確。結論:livina特異性shRNA表達載體的構建成功,可進一步研究該shRNA對該細胞株內源目的基因的干擾作用及對細胞的影響,為體外研究與livina相關的癌癥的治療探索新的生物途徑。

livina;shRNA;表達載體

Livin是抑制細胞凋亡蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IA P)家族的新成員。它含桿狀病毒 IA P重復序列(baculoviral IA Prepeats,BIR)和羧基端指環(RING)結構域。其BIR功能區可與胱天蛋白酶(caspase)結合,抑制caspase的活性,尤其是caspase-3/-7和caspase-9的活性達到阻斷凋亡受體和以線粒體為基礎的凋亡途徑而起作用。其轉錄產物因剪切方式的不同產生兩種mRNA亞型,分別稱為livina及livinβ,livina和livinβ分別編碼298個氨基酸和280個氨基酸的蛋白質。Gazzaniga P等[1]用半定量RTPCR技術檢測livina、livinβ的表達,發現livina在正常膀胱組織中不表達,而在一些具高復發率的實體瘤細胞中高表達。他們推測livin可能在淺表性膀胱癌中表達,可用于早期診斷。研究表明livina在肺癌的發生,以及化療耐藥抗放射等過程中起重要作用,livina較livinβ對放射線的抵抗力更強[2]。正是因為livin在一些腫瘤細胞中高表達,與腫瘤的關系為人們所關注,成為腫瘤治療的潛在靶點,目前以livin作為促凋亡治療靶點的研究也已經開展。

RNAi(RNA interference)技術已經成為在多種有機體中研究基因功能的一個必不可少的研究工具。RNA i技術以它高穩定性、高效性、小分子性、高特異性、高穿透性的特點,作為基因沉默的新技術備受關注。科學家很快認識到了RNA i的治療潛力。目前國外有多家公司正在研發RNA i藥物,有的正處于臨床試驗階段。RNAi技術結合已有的高效基因傳遞系統,使RNA i成為當今高效特異而又簡便易行的基因治療工具[3]。

shRNA最接近生命自然狀態中的dsRNA,RNA干擾效果也最好。本文就是構建livina的特異性shRNA表達載體,轉染入可表達目的基因的腫瘤細胞株后,可以特異性阻斷目的基因的表達。這對于今后研究特異的shRNA在該細胞株中對外源目的基因的表達及對細胞狀態的影響或在此基礎上進一步的研究該shRNA對該細胞株內源目的基因的干擾作用,為體外研究與livina相關的癌癥的治療探索新的生物途徑。

1 材料

1.1 質粒及菌株

質粒pGenesil-1購自武漢晶賽生物工程技術有限公司,是以pEGFP-C1質粒為骨架改造獲得的,可表達增強型綠色熒光蛋白,pGenesil-1的圖譜如圖1所示。大腸桿菌菌株DH5a由本教研室保存。

圖1 pGenesil-1的圖譜

1.2 主要試劑

LB培養基,LB瓊脂板培養基平板(自配)[4],Kanna(上海華舜生物),質粒提取試劑盒(Sigma公司),瓊脂糖,TA E溶液,凝膠回收試劑盒(中鼎公司),質粒小提試劑盒(中鼎公司),BIRC7 cDNA(武漢三鷹公司),T4 DNA Ligase、BamH I、H indIII、SalI、BglII、XhoI(N EB 公司)。

2 方法

2.1 Livin異構體特異性shRNA的設計與合成

GenBank查詢獲得 livina(即BIRC7)基因cDNA 序列(GI:15680240),利用武漢晶賽生物工程技術有限公司的在線siRNA設計輔助工具尋找潛在的靶位點,通過BLA ST分析去除和人類基因有同源性的序列,并通過RNA二級結構分析篩選出2個合適的靶位點,所設計的靶點為19nt的寡核苷酸序列:5’GTCTGGCCTCCTTCTA TGA 3’(417～435bp),5’TCCA TCGTCTTTGTGCCGT 3’(929～ 947bp),5’GACTTCA TAA GGCGCA TGC 3’(陰性對照序列)。根據三段序列及pGenesil-1的結構特點,設計并合成對應于這三段寡核苷酸序列的cDNA模版序列,其結構為:BamH I+Sense+Loop+A ntisense+終止信號+ SalI+H indIII,其實驗原理如圖2所示。

圖2 三段寡核苷酸序列的cDNA模版序列結構

插入質粒的三段cDNA模版序列為:(與上面的三個目標序列對應)

以上序列由武漢晶賽生物工程技術有限公司合成。

2.2 shRNA表達載體pGenesil-1-shRNA的構建(其構建流程如圖3)與酶切

圖3 pGenesil-1-shRNA的構建流程圖

2.2.1 單鏈目的基因片段的退火連接

各用50μLannealing buffer溶解上述合成2OD單鏈目的基 因片段,各取2μL(即2μLA+2μLB)+16μLannealing buffer混勻,94℃水浴退火自然冷卻至室溫,各取1退火產物+99μLH2O 做100倍稀釋。

2.2.2 線性化pGenesil-1

用BamH I+H indIII雙酶切,1%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠回收大片段。

2.2.3 退火片段分別與線性化pGenesil-1質粒表達載體的連接

稀釋退火片段1μL,線性化pGenesil-1質粒載體1μL,10×Ligase Buffer 1μL,T4DNA Ligase 1μL,H2O 6μL,22℃水浴反應過夜。

2.2.4 shRNA表達載體的擴增與鑒定

各取5μL過夜連接產物轉化感受態細胞DH5a,分別涂布于含Kanar抗性(終濃度為20μg/mL)的LB平板上,37℃恒溫箱培養過夜。從每個培養皿上各挑取3個單克隆菌落接種于3mL含Kanar抗性(終濃度為20μg/mL)的LB培養液中,37℃恒溫搖床(250rpm)培養過夜。用小提試劑盒按說明書小量提取質粒,并分別用SalI酶切,1%瓊脂糖凝膠電泳,檢測陽性克隆。

2.3 融合表達載體pEGFP-BIRC7-shRNA的構建(其構建流程如圖4)與酶切

圖4 pEGFP-BIRC7-shRNA的構建流程圖

2.3.1 目的基因BIRC7的擴增

BIRC7上游引物:BglII 5’gaagatctA TGGGACCTAAA GACA GTGCCA 3’ BIRC7 下 游 引 物:XhoI5’ccgctcgagCTA GGACA GGAA GGTGCGCA 3’(小寫字母為保護堿基+ 酶切位點)以BIRC7(c DNA)為模板,體外PCR擴增基因BIRC7,1%瓊脂糖凝膠電泳回收BIRC7基因,在紫外燈光下切膠回收,用膠回收試劑盒,按說明書回收,用30μLH2O洗脫。

2.3.2 PCR反應產物與pGenesil-1-shRNA的雙酶切

pGenesil-1-shRNA和PCR回收產物livin的BglII+XhoI雙酶切:DNA 6μL,10×H Buffer 2μL,BglII 1μL,XhoI 1μL,H2O 10μL。37℃水浴反應過夜。

2.3.3 PCR反應產物與pGenesil-1-shRNA的雙酶切片斷的連接

BIRC7基因片段4μL,質粒pGenesil-1-shRNA 雙酶切大片段4μL,10×Ligase Buffer 1μL,T4 DNA Ligase 1μL,22℃水浴反應過夜。

2.3.4 融合表達載體pEGFP-BIRC7-shRNA的擴增與酶切

各取5μL過夜連接產物轉化感受態細胞DH5а,分別涂布于含Kanar抗性(終濃度為20μg/mL)的LB平板上,37℃恒溫箱培養過夜,從每個培養皿上各挑取3個單克隆菌落接種于3mL含Kanar抗性(終濃度為20μg/mL)的LB培養液中,37℃恒溫搖床(250rpm)培養過夜,用小提試劑盒小量提取質粒(中鼎公司),并分別用BglII+XhoI做酶切。反應條件如下:質粒 DNA 6μL,10×H Buffer 2μL,BglII 1μL,XhoI 1μL,H2O 10μL,37℃水浴反應3h。1% 瓊脂糖凝膠電泳,檢測陽性克謾。

2.4 質粒pEGFP-BIRC7-shRNA的測序

送轉化菌液去測序。

3 結果

3.1 pGenesil-1的雙酶切

圖5中泳道1為質粒pGenesil-1,泳道2為經過雙酶切的線性化質粒pGenesil-1。因結構的不同線性化質粒較酶切前質粒電泳速度慢,因而應跑在質粒pGenesil-1的后面,如圖所示,質粒pGenesil-1已經線性化。

圖5 質粒pGenesil-1的雙酶切圖

3.2 pGenesil-1-shRNA的酶切

質粒pGenesil-1的多克隆位點(MCS)具有Sal1酶切位點,在目的基因cDNA模版結構中也設計有Sal1酶切位點,兩位點間的最小距離約為400bp。圖6所示泳道2、4、6為酶切前的 pGenesil-1-shRNA,泳道3、5、7為經 Sal1酶切的pGenesil-1-shRNA,經Sal1酶切的質粒應跑出約400bp的小帶,圖6所示,pGenesil-1-shRNA構建成功。

圖6 Sal1酶切電泳圖

3.3 pEGFP-BIRC7-shRNA的雙酶切

插入的目的基因為該基因的CDS區,共897bp,由pEGFP-BIRC7-shRNA的構建流程圖可知,經BglII+XhoI雙酶切的pEGFP-BIRC7-shRNA可切出一條長為897bp的小帶。由圖7所示泳道3、5、7跑出了約900bp的小帶,因此說明pEGFP-BIRC7-shRNA構建成功。

圖7 BglII+XhoI雙酶切電泳圖

3.4 質粒pEGFP-BIRC7-shRNA的測序

測序圖如圖8(包括8-1,2,3,4)所示。在原質粒pEGFP基礎上先插入了干擾序列,然后在EGFP上連接了目的基因的CDS區,使之融合表達。圖8-1為三個質粒共有部分的測序圖,目的是對目的基因的CDS區進行測序,由圖可知目的基因的CDS區成功插入了質粒。圖8-2,3,4對三個質粒的不同的部位進行測序,由圖可知兩段干擾序列及陰性對照序列也插入成功。

8-1 pEGFP-BIRC7的測序圖

4 討論

Andrew Z.Fire和Craig C.Mello由于在RNA干擾(RNA interference,RNA i)及基因沉默現象研究領域的杰出貢獻而成為諾貝爾醫學獎獲得者。RNA i是近年來發現的研究生物體基因表達、調控與功能的一項嶄新技術,它利用了由小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)引起的生物細胞內同源基因的特異性沉默(silencing)現象,其本質是siRNA與對應的mRNA特異結合、降解,從而阻止mRNA的翻譯。RNA i是生物進化的結果,是生物體對病毒基因等外源核酸侵入的一種保護性反應。它普遍存在于各種生物,具有抗病毒、穩定轉座子及監控異常表達mRNA的生物學功能。RNA干擾現象不僅能提供一種經濟、快捷、高效的抑制基因表達的技術手段,而且有可能在基因功能測定,基因治療等方面開辟一條新思路。shRNA最接近生命自然狀態中的dsRNA,RNA干擾效果也最好。shRNA包含兩個有一個小環序列所分離的短反向重復序列,是由PolIII啟動子控制的,其中一個反向重復序列與目的基因互補,shRNA隨后被加工成siRNA,降解目的基因的mRNA,抑制目的基因的表達。

livin的表達產物的功能被高度概括為:①對細胞凋亡的抑制作用;②有正負兩種生物功能的調節,以livin為靶點的抗腫瘤策略的研究已取得了初步進展。livin因子的研究對于探討腫瘤的發生、發展、治療和預防都有重要意義[3]。

本文以livina為靶基因,根據siRNA設計原則[5],并通過RNA二級結構分析,設計了2條針對目的基因的shRNA序列,一條陰性對照序列,并成功克隆至pGenesil-1中,構建了pGenesil-1-shRNA載體,在此基礎上又構建了融合表達載體pEGFP-BIRC7-shRNA,該載體所攜帶的序列位于基因的CDS區,轉染進入可表達目的基因的腫瘤細胞株后,可以特異性阻斷目的基因的表達。對于研究特異的shRNA在該細胞株中對外源目的基因的表達的影響,及對細胞狀態的影響。在此基礎上可進一步的研究該shRNA對該細胞株內源目的基因的干擾作用,及對細胞的影響。這為體外研究與livina相關的癌癥的治療探索出了一條新的生物途徑。

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Construction of livinaiso form-specific shRNA expression vector and clone identification

ZHANG Chun-bin,RAO Dong-mei,JIANG Li-song,LIU Shuang,ZHANG Yu-ping,JIANG Qing-lin
(College of Basic Medicine,Jiamusi University,Jiamusi 154007,China)

Objective:Toconstruct livinaspecific shRNA expression vectors and To verifywhether the livin-targeting RNA-interfering recombinant plasmids will be successfully constructed and transformed into E.colior not.Methods:Livinaspecificsh RNA expression vectors were constructed by inserting livinac DNA and shRNA to vectorp Genesil-1,and then electrophores with agrose gel after being digested by the restriction enzyme and sequence analysis.Results:Inserted gene was exactly attested by the restriction enzyme and partial sequence analysis.Conclusion:The recombinant vectors have been constructed successfully,which will help further studies of the shRNA interference onits cell line endogenous target gene and supply a biologicalways to treat cancer correlated with livina.

livina;shRNA;expression;vectors

Q 78

A

1008-0104(2011)06-0001-04

2011-09-13)

黑龍江省教育廳科學技術研究項目,編號:11511399;黑龍江省研究生創新科研資金項目,編號:YJSCX2005-113HLJ;黑龍江省衛生廳資助項目,編號:2006-345。

張春斌(1972～)男,黑龍江伊春人,在讀博士,副教授,碩士研究生導師。

江清林(1964～)男,悔龍江林口人,碩士,研究員,碩士研究生導師。E-mail:zcb19721972@yahoo.com.cn。