乳酸菌基因組學與干酪風味的關系

陳琦，馬燕芬，王利

（1.內蒙古醫學院分子生物學研究中心，呼和浩特 010059；2.內蒙古農牧業科學院動物營養所，呼和浩特 010030）

乳酸菌基因組學與干酪風味的關系

陳琦1，馬燕芬2，王利1

（1.內蒙古醫學院分子生物學研究中心，呼和浩特 010059；2.內蒙古農牧業科學院動物營養所，呼和浩特 010030）

介紹了乳酸菌的基因組學、乳酸菌與干酪風味之間的關系以及干酪的成熟機制。乳酸菌基因組學研究有助于揭示乳酸菌的遺傳和代謝機制，挖掘重要益生功能基因，為乳酸菌的在干酪生產中的應用提供基礎。

乳酸菌；基因組學；干酪；風味

0 引 言

乳酸菌（Lactic Acid Bacteria，LAB）是一類能夠通過同型發酵或異型發酵而產生乳酸的細菌[1]。根據發酵形式不同，乳酸菌可以分為兩類：同型發酵菌主要產物為乳酸，而異型發酵菌除乳酸還同時產生乙酸、乙醇、二氧化碳及甲酸等[2]。乳酸菌具有加速食品酸化、產生風味物質、增加食物營養并改善食品質地等功能。實驗證明，使用特色的發酵劑，更有利于大量生產均質、高質量的干酪。干酪工業的發展前景和經濟活力依賴于一些已知、可以預測并具有特色的發酵劑，因此為了挖掘乳酸菌的潛力，研究者致力于乳酸菌基因組學研究，期待從分子水平揭示乳酸菌的多樣性，闡明乳酸菌的生理及代謝機制，挖掘控制重要性狀的功能基因，提高發酵食品的工業化控制水平，為高效利用乳酸菌提供依據[3]。

1 乳酸菌的基因組學

1.1 與干酪相關的基本特征

根據伯杰細菌鑒定手冊，乳酸菌目前主要分為23個屬，主要有乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lacto-coccus）、明串珠菌屬/白聯球菌屬（Leuconoszo）、片球菌屬（Pediococcus）、鏈球菌屬（Streptoeoccus）、腸球菌屬（Enleroccu）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和肉食菌屬（Caroobaelerium）等[4]。LAB新陳代謝的主要終產物是乳酸，其中乳桿菌、乳球菌、名串珠菌和鏈球菌是重要的工業菌。

乳酸菌廣泛分布于自然界中，主要特性為低鳥嘌呤+胞嘧啶（G+C）含量（＜55%）、強耐酸性、不產生孢子、營養要求高、耐氧但不需氧、不能合成卟啉。乳酸菌基因組的大小在1.8～3.2 Mb之間，基因數量和可以預測的蛋白質數量相差較大，干酪乳桿菌ATCC334的基因組相對比較大，為3.35 Mb，以上這些差異表明乳酸菌正處于一個動態的進化過程中[5]。大多數乳酸菌基因組G+C含量都在50%以下，唾液乳桿菌UCC118的G+C含量最低，只有33%，而雙歧桿菌的G+C含量高達60.1%。盡管LAB各個菌屬RNA結構基因數量各異，但都含有rRNA操縱子和tRNA編碼基因，某些LAB還含有質粒與噬菌體編碼基因，其中rRNA操縱子和tRNA編碼基因屬于基本功能基因，質粒與噬菌體編碼基因屬于特殊功能基因。

LAB各個菌屬的rRNA操縱子數量變化較大，其中乳桿菌屬的rRNA操縱子數量較多。rRNA操縱子排列具有一定順序性，通常為16s rRNA，23s rRNA，5s rRNA，而且在它們周圍常常會出現tRNA Ile，tRNAAla，tRNALys等編碼基因。tRNA編碼基因數量為43～98個，同樣乳桿菌屬偏多。

有些乳酸菌，特別是乳球菌，菌體細胞內含有多種質粒，大小從1.9～242 kb不等[6]。許多與工業化生產相關的性狀都是由這些質粒編碼的，如乳糖代謝酶類、攝取檸檬酸鹽的酶、蛋白水解酶類、細菌素的生成、噬菌體抗性、多糖的合成等[7]。明串珠菌ATCC8293和部分乳桿菌細胞中含有質粒，德式乳桿菌和大多數嗜熱鏈球菌細胞中則沒有質粒，乳酸乳球菌SK11細胞中包括5個不同種類的質粒。此外，還有一些乳酸菌具有復雜的插入重復序列（IS），說明這些LAB有較高的遺傳可塑性[8]。某些LAB中還含有噬菌體編碼基因，但數量通常都很少，僅僅為1-2個。乳酸乳球菌乳脂亞種MG 1363中的噬菌體編碼基因都攜帶有tRNA編碼基因，還含有一個噬菌體矯正序列，其中包括一個長度為712個氨基的插入序列。

1.2 與干酪相關的研究進展

早期對乳酸菌的研究工作大多集中于菌種的分類和菌株的篩選以及構建動物模型對部分益生特性進行驗證等方面的研究。隨著分子生物學理論及生物技術的發展，人們開始利用分子生物學方法對乳酸菌的分類、基因功能及其代謝途徑進行研究。LAB中與細胞分解代謝及合成活動相關的所有管家基因都定位在染色體上，因此了解LAB染色體結構和組成對于了解細胞分解代謝和合成具有重要意義。研究發現特定基因的微小變化或突變都會導致蛋白質發生變化，進而使奶酪的品質發生極大的變化。

自Sorokin等（2001）完成第一株乳酸菌——乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis ssp.lactis）IL1403的全基因組測序以來，掀起了乳酸菌全基因組測序的浪潮。美國成立了乳酸菌基因組協會 （LAB Genomics Consortium，LABGC），對多種乳酸菌進行全基因組測序。迄今為止，已經發表的乳酸菌基因組達22株，絕大多數是由美國和歐洲等發達國家的實驗室完成的。表1列出了已完整公布全基因組序列的乳酸菌和幾個工業上比較重要的LAB菌種的基因組序列信息，14個菌種的基因組信息是公開的，其中10個是由美國的乳酸菌基因組聯盟（LABGC）研究的結果。

對乳酸菌基因組學的深入研究有利于其在乳品發酵方面應用，例如：篩選具有特定胞外多糖特性及數量的嗜熱鏈球菌；分析乳酸菌的基因組可以將其的基因特點和益生功能聯系起來在分子水平上篩選具有特定功效的菌株；進一步探索噬菌體的分子進化規律，闡明乳酸菌噬菌體的機制。

嗜酸乳桿菌NCFM是全球第一個完成基因序列的商業菌株。通過對該菌株的全基因序列分析，可以將其基因序列的某些片段與菌株的生物化學，生理特性及功能，加工與儲存特性（如菌株的發酵條件，儲存過程的穩定性，凍干條件）相聯系。

表1 與乳制品有關的乳酸菌和其他菌種的基因組序列

嗜熱鏈球菌是工業化應用中最重要的乳酸菌之一，廣泛地用于多種奶酪和酸奶的生產，近年來對嗜熱鏈球菌噬菌體的廣泛和深入研究也成為熱點。目前，已經公開發表的嗜熱鏈球菌噬菌體的完整基因序列有7種，包括cos-類噬菌體DT1,Sfi19,Sfi21,7201及pac-類噬菌體O1205,Sfi11和2972。

鼠李糖乳桿菌Howaru Rhamnosus也是目前研究較多的、保健功效較強的益生菌。研究證明其具有調整腸道菌群，抑制腸道有害菌，激活免疫功能等功效。測序研究發現其已知基因900多個，其中300多個和益生菌功能有關。該菌株能夠合成除色氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、頡氨酸之外的全部氨基酸，還可以合成葉酸、亞鐵原卟啉、維生素B1等生長因子。

2 乳酸菌基因組學與干酪風味

干酪風味是由干酪中的揮發性風味物質和芳香性風味物質組成的混合物，主要包括原料乳中的風味化合物及成熟過程中酶和微生物作用于基質產生的風味化合物。具有風味活性的物質多數是有機物，包括酸、醇、酯、內酯、酮、酚、醛、醚等。

雖然早在100年前就已經發現LAB和干酪風味之間的關系，但由于微生物學、酶學和干酪微環境的復雜性，早期很難定義LAB是如何影響干酪風味的。直到20世紀50年代后期，英國食品研究學院的Elisabeth Sharpe等發明了無菌加工干酪技術，進而證明LAB是產生干酪風味所必需的。

許多微生物對干酪風味的形成是至關重要的。干酪微生物主要分為兩大類：發酵微生物和次級微生物。發酵微生物在干酪的制作過程中主要起著產酸和促進凝乳的作用。主要的發酵微生物是乳酸菌（LAB），不同種類的LAB也可能影響干酪風味，這個領域的研究主要集中在乳酸球菌屬，它是切達干酪，高達干酪及許多其它干酪和與牛奶有關的乳酸菌品種的發酵劑。由于工業化方面的應用，已經對乳酸乳球菌代謝機制、遺傳、分子生物學和生理方面進行了廣泛深入的研究，并已成為乳酸菌研究的模式菌[4]。乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）主要用作干酪的發酵劑，分為乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactis ssp.cremoris）和乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis ssp.lactis），前者適用制作硬質奶酪，后者適用制作軟質奶酪。次級微生物在干酪的制作過程中不能產酸，但在成熟過程中對風味形成有著很重要的作用。非發酵劑乳酸菌（NSLAB）是其中主要的次生菌群。

干酪在成熟開始時，發酵劑的數目通常每克干酪超過109CFU（見圖1），但是干酪成熟對微環境的要求很嚴格，比如殘留乳糖、高濃度的NaCl，低pH值和低溫都會影響發酵劑的成活率，大部分發酵劑自我分解，導致成熟細胞內的酶和其他細胞組分釋放到干酪組中，進而影響成熟過程。起初NSLAB菌群的數目一般在102CFU/g以下，然后開始生長，在成熟的3～9個月后細胞密度最終穩定在107CFU/g～109CFU/g（見圖1）。

3 干酪成熟機制

干酪成熟過程主要包括乳糖代謝、蛋白質水解和脂肪分解三大生化反應。在發酵劑的作用下，乳糖經糖酵解途徑或異戊二糖途徑產生乳酸；蛋白質在干酪中殘留的凝乳酶、乳內源性酶和微生物酶的作用下水解成肽和氨基酸；脂肪在脂肪酶作用下水解成脂肪酸、醇類、醛類等一系列化合物。

乳糖酵解后產生乳酸，產生乳酸的多少直接影響干酪的質量，因為在培養過程中，乳酸決定最終的pH值及凝乳中的礦物質含量，同時影響蛋白質結構和凝乳中殘留的促凝劑的數量，進而最終影響干酪的質地和風味。乳酸鹽本身也是形成干酪風味的成分，并將其轉化為丙酸和二氧化碳；丙酸也是形成干酪風味的重要成分，而二氧化碳則可以使干酪出現蜂窩眼。若發酵劑迅速耗盡凝乳中殘留的糖，這樣就可以避免產生異味的外來細菌利用凝乳中殘留的糖作底物（例如異發酵乳酸短桿菌），進而避免導致干酪品質下降。

蛋白質水解是干酪成熟過程中發生的3個基本生化反應中最重要而且最復雜的一個途徑。主要包括以下兩步：一是蛋白質降解（蛋白質水解、肽水解），二是游離氨基酸降解為風味物質，其中第二步是風味形成的關鍵。

蛋白質水解是多種酶參與的反應，包括凝乳酶、自身的胞漿素、來源于發酵劑和非發酵劑乳酸菌的微生物蛋白酶與肽酶。發酵劑將牛乳中的酪蛋白降解成能被細胞吸收的肽類和游離氨基酸[9]。酪蛋白的水解是由添加的凝乳劑催化，而LAB蛋白酶和肽酶主要生成水溶縮氨酸和自由氨基酸。在這個反應中產生的一些低分子量的苦味肽會直接影響干酪風味。釋放的游離氨基酸也會影響干酪風味，它們是產生干酪主要風味物質的前體。例如，谷氨酸鹽和天冬氨酸殘基可以增加風味。LAB作為初發酵劑在很多種干酪中得到應用，揭示這些微生物的蛋白水解體系是干酪成熟中的關鍵步驟。

氨基酸的分解代謝產生很多種物質，主要包括氨、胺、乙醛、苯酚、吲哚和乙醇，這些物質整體上有助于干酪風味的形成。實驗證明：LAB將自由氨基酸轉化為芳香氨基酸是干酪風味產生的關鍵步驟。氨基酸分解作用的產物會形成風味，這些分解作用包括脫羧、脫氨、轉氨、脫硫和側鏈水解。研究LAB分解代謝氨基酸都是針對芳香族、枝鏈及含硫氨基酸的降解物，因為它們在氣味中起關鍵作用。例如，蛋氨酸轉化為含硫揮發性化合物，這使得許多干酪制品含有特殊的風味。

脂肪酶或酯酶作用于奶脂肪產生的脂肪酸也直接影響干酪的風味，并且作為酯和其他風味成分的前體進一步發揮作用。而且酯酶和脂肪酶催化酯的水解與合成，主要取決于干酪中水的活性和其他可利用的脂肪酸及乙醇的水平。這些酶可能來自凝乳酶漿、牛奶本身及發酵劑和非發酵劑中的LAB。例如，反芻動物乳中的脂肪酶和酯酶能產生某些意大利干酪所特有的氣味。但是，用脫脂乳制成的硬質意大利干酪中，沒有使用脂肪酸酶和酯酶，與脂類分解作用有關的風味可能是由于本土的牛奶中的酶和微生物酶的作用。大多數LAB缺乏分解脂肪的活性，但是如果干酪成熟時間長，這些細菌可以生成足夠的自由脂肪酸和酯，從而影響風味。

最后，LAB利用檸檬酸鹽產生琥珀酸鹽或聯乙醯。琥珀酸鹽是一種類似谷氨酸鈉物質，可提高干酪中的風味，可以從幾種干酪中分離。從感官評價的研究結果表明琥珀酸鹽使得瑞士干酪風味易于被大眾接受，同時也使切達干酪產生特有的風味。瑞士干酪和其他干酪中，費氏丙酸桿菌亞種、丙酸桿菌的數目很多，琥珀酸產物主要參與丙酸菌中的天冬氨酸代謝。但是，在切達干酪和其他干酪中，NSLAB通過還原性三羧酸循環將檸檬酸鹽轉化為琥珀酸鹽。

另一個重要的源自檸檬酸的風味成分——聯乙醯，它在黃油、酪乳和一些干酪制品中的重要性已經得到公認。聯乙醯由-乙酰乳酸氧化分解形成，-乙酰乳酸是丙酮酸鹽代謝和氨基酸生物合成的中介。近幾年，對檸檬酸鹽代謝和聯乙醯產物的深入研究，使得可以有效控制乳球菌以提高聯乙醯產量。

4 結束語

綜上所述，乳酸菌基因組學的研究可以拓寬對乳酸菌的認識，從微觀角度理解乳酸菌及其功能基因，揭示乳酸菌的遺傳和代謝機制，為闡明LAB影響干酪風味的基礎機制奠定基礎，這將有利于乳制品企業在生產過程中提高干酪風味。隨著乳酸菌基因組學一級相關交叉學科（如生物信息學和計算機學等）的進一步發展，將極大的推進乳酸菌應用于干酪生產以提高干酪的風味。

[1]BERESFORD T P,FITZSIMONS N A,BRENNAN N L,et al.Recent Advances in Cheese Microbiology[J].Int.Dairy J.,2001,11：259–274.

[2]BROADBENT J R.Genetics of Lactic Acid Bacteria[M].Marcel Dekker,Inc.,New York，2001：243–299.

[3]SIEZEN R J,ENCKEVORT F H J,KLEEREBEZEM M,et al.Genome Data Mining of Lactic Acid Bacteria：the Impact of Bioinformatics[J].Current Opinion in Biotechnology,2004,15：105-115.

[4]凌代文.乳酸細菌的分類鑒定及實驗方法[M].北京：中國輕工業出版社,1999.

[5]MAKAROVA K S,KOONIN E V.Evolutionary Genomics of Lactic Acid Bacteria[J].Journal of Bacteriology,2007,189（4）：1 199-1 208.

[6]PFEILER E A,KLAENHAMMER T R.The Genomics of Lactic Acid Bacteria[J].Trends Microbiol,2007,15（12）：546-553.

[7]KO K J.Comparative and Functional Genomics of Lactococci[J].FEMS Microbiol Rev.,2005,29（3）：411-433.

[8]TODD R,KLAENHAMMER R B,LOGAN BUCK B.Genomic Features of Lactic Acid Bacteria Effecting Bioprocessing and Health[J].FEMS Microbiol Rev.,2005,29：393-409.

[9]CHRISTENSEN J E，DUDLEY E G，PEDERSON J A,et al.Peptidases and Amino Acid Catabolism in Lactic Acid Bacteria[J].Ant.Leeuwenhock,1999,76：217-246.

Relationship between Lactic Acid Bacteria genomics and cheese flavor

CHEN Qi1，MA Yan-fen2，WANG Li1
（1 Research Center of Molecular Biology,Inner Mongolia Medical College，Hohhot 010059，China;2 Animal Nutrition Institute,Inner Mongolia Academy of Animal Science，Huhhot 010030，China）

This paper has reviewed the genomics of LAB,the relationship between LAB and cheese flavor and the mechanism of Cheese Ripening.These studies will contribute to reveal the genetic and metabolic mechanisms of Lactic Acid Bacteria,promote the finding of important functional genes,and provide the basis for applying LAB into cheese production.

Lactic Acid Bacteria；Genomics；cheese；flavor

Q966,TS252.53

B

1001-2230（2011）10-0040-04

2011-07-21

內蒙古醫學院博士啟動金（nybq2010cq）。

陳琦（1980-），女，副研究員，研究方向為分子生物學與基因組學。