牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附檢測法的建立

摘要：采用辛酸－硫酸銨法提取兔抗ＢＶＤＶ高免血清中的免疫球蛋白ＩｇＧ，在混合硝酸纖維素膜上進(jìn)行間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，建立了檢測ＢＶＤＶ抗原的斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附檢測法。結(jié)果顯示，抗體最佳包被量為４００μｇ／ｍＬ，酶標(biāo)記羊抗兔ＩｇＧ的最佳工作濃度是１∶５００倍稀釋，抗原最小檢出量是５．３６μｇ／ｍＬ。應(yīng)用建立的檢測方法對(duì)７８份腹瀉奶牛血樣進(jìn)行了檢測，陽性檢出率為５８．９７％；經(jīng)卡方（χ2）檢驗(yàn)分析，建立的間接Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ與ＡＧＰ法相比較，陽性檢出率差異顯著。證實(shí)該方法敏感性高、簡便快速，適合于基層獸醫(yī)的檢測診斷。

關(guān)鍵詞：牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒；斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附法；檢測

中圖分類號(hào)：Ｓ８５２．５＋３文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：１００７－２７３Ｘ（２０11）05-0009-03

牛病毒性腹瀉病毒病是由黃病毒科、瘟病毒屬的牛病毒性腹瀉－黏膜病毒（Ｂｏｖｉｎｅ Ｖｉｒａｌ Ｄｉａｒｒｈｅａ－Ｍｕｃｏｓａｌ Ｄｉｓｅｅａｓｅ Ｖｉｒｕｓ，ＢＶＤ－ＭＤＶ）引起的，臨床上以發(fā)熱、黏膜糜爛潰瘍、白細(xì)胞減少、腹瀉、懷孕母牛流產(chǎn)或產(chǎn)畸型胎兒為主要特征［１］。１９４６年美國人Ｏｌａｆｓｏｎ首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道此?。郏玻?，目前已呈世界性分布。

目前診斷該病的方法有病毒分離、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等［３］，但這些方法存在檢出率低、檢測時(shí)間長等缺點(diǎn)，尤其是對(duì)于免疫耐受和持續(xù)性感染的牛出現(xiàn)漏檢。本研究旨在建立一種簡便有效的檢測牛病毒性腹瀉病毒抗原的斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附法。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１抗ＢＶＤＶ高免血清的制備以ＢＶＤＶ－Ｏｒｅｇｏｎ Ｃ２４Ｖ標(biāo)準(zhǔn)毒株的ＭＤＢＫ細(xì)胞培養(yǎng)物作為免疫原按常規(guī)方法免疫健康家兔［４，５］，待效價(jià)達(dá)１∶１２８時(shí)，心臟采血，收集血清，－２０℃保存?zhèn)溆谩?/p>

１．１．２兔抗ＢＶＤＶ ＩｇＧ的提?。郏叮輰⑼每梗拢郑模指呙庋逡孕了幔蛩徜@法提純免疫球蛋白ＩｇＧ。

１．１．３樣品及處理待測樣品為河北省不同地區(qū)采集的腹瀉牛血樣，－２０℃保存。ＢＶＤＶ陽性血樣和ＢＶＤＶ陽性糞樣為自然感染腹瀉奶牛血樣與糞樣，經(jīng)電鏡檢查含有大量ＢＶＤＶ粒子。

１．２間接斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附法檢測ＢＶＤＶ抗原方法的建立

１．２．１間接Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ的操作程序操作流程：壓跡—點(diǎn)樣—洗滌—封閉—加抗體—加酶標(biāo)羊抗兔—顯色—終止反應(yīng)—判定結(jié)果。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：以在膜圓圈內(nèi)出現(xiàn)明顯棕紅色斑點(diǎn)判定為陽性，無色為陰性。

１．２．２間接Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ試驗(yàn)條件的選擇

（１）抗體最佳工作濃度的篩選：用抗體稀釋液將純化ＩｇＧ稀釋成５０、 １００、 ２００、 ３００、 ４００、 ５００、６００μｇ／ｍＬ，包被膜片，浸洗３次，封閉。將陽性抗原（ＢＶＤＶ病毒濃縮液）以抗原稀釋液作１∶１０倍稀釋，酶標(biāo)羊抗兔作１∶５００、１∶１ ０００倍稀釋，依次加入各孔，１００μＬ／孔，置３７℃溫箱１ｈ，洗滌。以出現(xiàn)斑點(diǎn)顏色最深、背景顏色最淺的ＩｇＧ的量和酶標(biāo)羊抗兔的稀釋度作為本試驗(yàn)的工作濃度。

（２）抗原最低檢出量的確定：用抗體稀釋液以工作濃度稀釋抗體，將陽性抗原以抗原稀釋液作１∶２０、１∶４０、１∶８０、１∶１６０、１∶３２０、１∶６４０、１∶１ ２８０、１∶２ ５６０、

１∶５ １２０倍稀釋，然后加入最適濃度的酶標(biāo)羊抗兔，以出現(xiàn)斑點(diǎn)顏色最深，背景顏色最淺時(shí)陽性抗原最大稀釋倍數(shù)所對(duì)應(yīng)的抗原濃度即為抗原最低檢出量。

１．２．３間接Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ的特異性試驗(yàn)

（１）特異性阻斷試驗(yàn)：將ＢＶＤＶ濃縮液分別與標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、正常兔血清、兔抗ＢＶＤＶ陽性血清、兔抗ＢＶＤＶ ＩｇＧ和正常ＭＤＢＫ細(xì)胞液混合，置３７℃溫箱１ｈ，然后進(jìn)行間接Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ試驗(yàn)，根據(jù)結(jié)果出現(xiàn)斑點(diǎn)的情況確定試驗(yàn)的特異性。

（２）交叉性試驗(yàn)：用建立的間接Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法對(duì)ＢＶＤＶ細(xì)胞培養(yǎng)液、ＢＶＤＶ陽性血樣、ＢＶＤＶ陽性糞樣、輪狀病毒、豬瘟兔化弱毒疫苗、健康牛血樣、正常ＭＤＢＫ細(xì)胞液進(jìn)行檢測，觀察結(jié)果。

（３）重復(fù)性試驗(yàn)：將ＢＶＤＶ細(xì)胞培養(yǎng)液、ＢＶＤＶ陽性血樣、正常ＭＤＢＫ細(xì)胞液、健康牛血樣、ＢＶＤＶ陽性糞樣按已建立的間接Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法重復(fù)檢測３次，觀察結(jié)果。

１．２．４Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法的初步應(yīng)用用建立的Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法和ＡＧＰ法分別對(duì)河北省不同地區(qū)采集的７８份腹瀉奶牛血樣進(jìn)行檢測。

２結(jié)果與分析

２．１抗體最佳工作濃度的篩選

經(jīng)方陣法測定，兔抗ＢＶＤＶ ＩｇＧ的最佳工作濃度為４００μｇ／ｍＬ，酶標(biāo)羊抗兔的最佳稀釋濃度是１∶５００倍稀釋（表１）。

２．２抗原最低檢出量的確定

結(jié)果見表２，由表２可見，間接Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法最低可檢出１ ２８０倍稀釋的病毒濃縮液，即５．３６μｇ／ｍＬ。

２．３間接Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ的特異性試驗(yàn)

２．３．１阻斷試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果表明，兔抗ＢＶＤＶ陽性血清和兔抗ＢＶＤＶ ＩｇＧ可阻斷ＢＶＤＶ與酶標(biāo)抗體之間的陽性反應(yīng)，而標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、正常兔血清和正常ＭＤＢＫ細(xì)胞液不能阻斷ＢＶＤＶ與酶標(biāo)抗體之間的陽性反應(yīng)（表３）。

２．３．２交叉性試驗(yàn)結(jié)果見表４。由表４可見，經(jīng)間接Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ檢測，ＢＶＤＶ細(xì)胞培養(yǎng)液、ＢＶＤＶ陽性血樣、ＢＶＤＶ陽性糞樣反應(yīng)陽性，而與豬瘟兔化弱毒疫苗、正常ＭＤＢＫ細(xì)胞液、健康牛血樣、輪狀病毒無交叉反應(yīng)。

２．３．３重復(fù)性試驗(yàn)從表５可以看出，３次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果差異不明顯，說明這種方法重復(fù)性很好。

２．４Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法的初步應(yīng)用

從河北省不同地區(qū)采集腹瀉奶牛血樣７８份，用ＡＧＰ法和建立的Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法進(jìn)行檢測，結(jié)果見表6。Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和ＡＧＰ的ＢＶＤＶ陽性檢出率分別為５５．１３％和３４．６２％。經(jīng)卡方（χ２）檢驗(yàn)分析，這兩種方法比較，χ２＝６．６３４，差異顯著（Ｐ＜０．０５）。

３討論

目前臨床上檢測ＢＶＤＶ的常用的病毒分離法和中和試驗(yàn)需要細(xì)胞培養(yǎng)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適合大規(guī)模的病毒檢測和流行病學(xué)調(diào)查；瓊擴(kuò)試驗(yàn)準(zhǔn)確性不高，檢出率較低；ＥＬＩＳＡ法需要酶標(biāo)檢測儀等貴重儀器，不利于基層使用。而Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法操作簡便，費(fèi)用低，只需要２～３h即可得出結(jié)果且結(jié)果判斷直觀，而且能從樣品中檢出持續(xù)性感染的動(dòng)物，適用于基層單位對(duì)ＢＶＤＶ的檢測和流行病學(xué)調(diào)查。本試驗(yàn)應(yīng)用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法和ＡＧＰ法對(duì)７８例臨床病例進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法與ＡＧＰ相比較，陽性率差異顯著，該方法的陽性檢出率明顯高于ＡＧＰ，表明Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法具有高度敏感性，非常適用于臨床診斷和檢疫。

參考文獻(xiàn)：

［１］王新平，劉紅，宣華，等．綿羊感染牛病毒性腹瀉－粘膜病病毒的調(diào)查研究［Ｊ］．獸醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，１９９３，１３（３）：２1９－２２1．

［２］ＯＬＡＦＳＯＮ Ｐ，ＭACＣＡＬＬＵＭ Ａ Ｄ，ＦＯＸ Ｆ Ｈ． Ａｎ ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ ｎｅｗ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｃａｔｔｌｅ［Ｊ］． Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｖｅｔ，１９４６，３６：２０５－２１３．

［３］殷震，劉景華．動(dòng)物病毒學(xué)（第二版）［Ｍ］．北京：科學(xué)出版社，１９９７．

［４］高存福．牛病毒性腹瀉病毒雙抗體夾心ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ診斷方法的建立及Ｅ２基因變異分析［Ｄ］． 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，２００５，６．

［５］王世若，王興龍，韓文瑜，等．現(xiàn)代動(dòng)物免疫學(xué)（第二版）［Ｍ］．長春：吉林科學(xué)技術(shù)出版社，２００１．

［６］白麗，王晶．應(yīng)用辛酸硫酸銨法提取小鼠腹水和血清中的ＩｇＧ抗體［Ｊ］．大理醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，２０００，９（４）：３－５．