丹參花藥愈傷組織誘導因素的研究

摘要：研究了不同激素處理、不同花粉發育時期、不同低溫預處理和高溫預培養對丹參花藥愈傷組織誘導的影響。結果表明：最佳的培養基激素組合為Ms+2.O mg／L6-BA+O.2mg／LN從；單核靠邊期的花藥愈傷組織誘導率最高；4℃低溫預處理2d最有助于愈傷組織發生；高溫預培養不利于愈傷組織誘導率的提高。

關鍵詞：丹參；花藥培養；愈傷組織

中圖分類號：$567.530.353 文獻標識號：A 文章編號：1001—4942(2010)08—0005—04

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參(Salviamiltiorrhiza Bge.)干燥的根及根莖，主要有效成分為丹參酮IA、丹參酮ⅡA和隱丹參酮等脂溶性二萜類化合物和丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、原兒茶醛等酚酸類化合物，為大宗常見中藥材，具有活血祛瘀，消腫止痛，養血安神的功效，現代藥理表明丹參在治療冠心病方面有顯著的療效。

隨著市場需求的增加，栽培丹參成為中藥丹參的主要來源。現在丹參市場存在種質混雜、質量參差不齊的現象，因此，有必要選育產量高、抗病性強、有效成分含量高的優良丹參品種。采用常規育種方法，獲得純系需要3—5年的時間，利用花藥培養可誘導單倍體植株，經加倍后可迅速獲得純系，縮短育種年限。

目前在很多作物上開展了花藥培養方面的研究，在枸杞、百合、枇杷等中藥植物中也開展了研究。有關丹參花藥培養方面的研究目前尚未見報道，本研究以丹參花藥為試驗材料。對影響丹參花藥愈傷組織誘導的關鍵因子進行了初步的探索，為丹參單倍體植株的獲得奠定了理論和技術基礎。

l 材料與方法

1.1試驗材料 2009年5月上中旬，在山東農業大學藥用植物園采集一年生丹參未開放花蕾的花序，用醋酸洋紅染色，檢查花粉發育時期。選用花粉發育處于單核靠邊期的花蕾進行培養。

1.2試驗方法

晴天午后采集未開放花蕾，4℃低溫保存2 d(溫度預處理的材料除外)，清水沖洗30 min，75％酒精浸泡30 s，10％次氯酸鈉消毒15 min，再用無菌水沖洗3～5遍，無菌條件下剝取花藥接種于MS培養基上，接種密度為20個花藥／瓶，每處理接種9瓶。MS培養基添加蔗糖30 g／L，瓊脂6／L，pH值為5.8～6.0，120～125％下滅菌20min。花藥愈傷組織誘導期間進行黑暗培養，溫度為(25±1)℃。30 d后調查愈傷組織誘導率。

1.2.1 不同激素配比對愈傷組織誘導的影響將花藥接入不同激素配比的MS固體培養基中，觀察不同激素配比對花藥愈傷組織誘導的影響。

1.2.2花藥不同發育時期對愈傷組織誘導的影響將不同發育時期的花藥分別接入MS+2.0m／L 6一BA+0.2 mg／L NAA的固體培養基中，觀察不同發育時期對愈傷組織誘導的影響。

1.2.3不同低溫預處理對愈傷組織誘導的影響 花蕾采摘后，進行4'E低溫預處理O、1、2、3、4d，處理后將花藥接入MS+2.0mg/L6一BA+O.2m/L NAA的固體培養基中，觀察不同低溫預處理時間對愈傷組織誘導的影響。

1.2.4不同高溫預培養對愈傷組織誘導的影響 花蕾采摘后直接進行處理，將花藥接入MS+2.O m／L 6一BA+0.2 m／LNAA的固體培養基中，放入35℃恒溫箱中預培養O、1、2、3、4 d，再置于25℃常溫下培養，觀察不同高溫預培養時間對愈傷組織誘導的影響。

2 結果與分析

2.1 不同激素配比對愈傷組織誘導的影響

以MS為基本培養基，6－BA、2，4－D、NAA為外源激素進行正交試驗(見表1)。從表1可以看出，添加激素能顯著提高花藥培養愈傷組織的誘導率，3種激素的極差大小依次為6一BA>2，4－D>NAA。不同的激素組合和濃度配比，對丹參愈傷組織的誘導效果不同，添加2.0 mg，／L 6－BA+0.2 mg／L NAA的培養基，愈傷組織誘導率最高，達到了84.2％，與其它處理相比，差異顯著(P<0.05)，說明2.O mg／L 6一BA+O.2 m／LNAA是丹參花藥培養中誘導出愈較好的激素配比。

2.2花藥不同發育時期對愈傷組織誘導的影響

從表2可以看出，小孢子處于4個發育時期的花藥都能誘導出愈傷組織，以單核靠邊期誘導率最高，為75.8％，與其它3個時期誘導率相比，差異顯著，因此認為以單核靠邊期的花藥為外植體進行愈傷組織的誘導較適宜。

2.3 不同低溫預處理對愈傷組織誘導的影響

將小孢子發育時期處于單核靠邊期的花蕾經過低溫(4℃)預處理后，愈傷組織誘導率差異顯著(表3)。4℃處理1～2 d，能顯著提高愈傷組織的誘導率，處理2 d，誘導率達最高，與未經低溫處理及低溫處理1 d的差異顯著。但隨著低溫處理時間的延長，誘導率迅速下降，低溫處理4 d的誘導率最低。說明小孢子發育處于單核靠邊期的花藥進行低溫預處理的適宜時間是2 d。

2.4不同高溫預培養對愈傷組織誘導的影響

將小孢子發育處于單核靠邊期的花藥接種在誘導培養基上進行35℃高溫預培養，發現隨高溫預培養時間的延長，愈傷組織誘導率下降(表4)。經高溫預培養后，花藥迅速變褐，轉到25\"C常溫下培養，比不經高溫預培養的花藥產生愈傷組織慢且長出的愈傷組織呈黃褐色，質地松散。說明高溫預培養不利于丹參花藥培養愈傷組織出愈率的提高。

3 討論與結論

外源激素對誘導花粉細胞的增殖和發育起著重要作用，不同作物、基因型及外植體對激素的種類和配比有不同的要求。角豆樹添加0.5 mg／L 2，4-D+4 mg／L TDZ愈傷組織誘導效果最好，小葉錦雞兒添加1.O mg／L 6-BA+3.O m／L 2。4一D組合對愈傷組織形成的效果最好，紫花苜蓿花藥誘導愈傷組織最佳的激素組合為O.5mg／L 2，4-D+0.2mg／LNAA+O.5 mg／L 6-BA+3 mg／L KT。本研究表明，添加6-BA、2，4-D、NAA三種激素組合均能誘導出愈傷組織，其中以6-BA作用最顯著。研究中發現添加2.O mg／L6-BA+2.O mg／L2，4-D的誘導率較高，但該組合的愈傷組織生長迅速，為白色松散愈傷組織，貼近培養基處有毛狀根生長，進行分化培養時愈傷組織不能轉綠，仍然保持愈傷組織生長狀態，可能2，4－D促進丹參花藥愈傷組織細胞分裂作用強烈，致使轉接后的愈傷組織中仍保留有較高濃度的2，4－D。本研究表明，添加2.Om／L 6一BA+0.2 mg／L NAA的培養基，愈傷組織誘導率最高，并且在此培養基上長出的愈傷組織顏色淡黃、質地緊密，轉到光下進行分化培養時愈傷組織能夠迅速轉綠，表面生成綠色芽點，綠苗分化率較高。

小孢子發育時期與愈傷組織的誘導存在密切關系。不同物種誘導胚胎發生的最佳小孢子時期不同，對大多數植物而言，小孢子發育時期為單核中期至晚期的花藥容易形成愈傷組織。黃瓜花藥培養愈傷組織誘導率最高的時期是單核中后期。百合花藥培養最適宜的時期是單核期。本研究表明丹參花藥培養的最佳小孢子發育時期為單核靠邊期，進一步證明了單核中期至晚期是大多數植物花藥培養誘導出愈的最好時期。

花蕾采集后進行一定時間的低溫預處理，既緩解了接種時間，對大多數植物的花藥誘導也具有良好的促進作用。但不同的植物，適合的低溫預處理時間不同。辣椒花蕾經l～7 d低溫預處理后花藥愈傷組織誘導率明顯高于對照。二倍體馬鈴薯花蕾在4℃低溫預處理48 h后接種花藥，可明顯提高愈傷組織誘導率。本試驗中接種的丹參花藥進行低溫預處理后，誘導率明顯提高，以低溫處理2 d誘導率最高，之后，隨著低溫處理時間的延長，誘導率下降。

花藥接種后先進行一定時間的高溫預培養，然后轉入25℃恒溫培養，能夠提高花藥培養的誘導率，一般以30—35~C處理l-3 d為宣。但丹參花藥接種后進行35℃高溫預培養1 d后，花藥表面變褐，愈傷組織誘導率低于不經高溫預培養的處理，且隨著處理時間的延長，花藥表面褐化加速，愈傷組織誘導率急劇下降。說明不同植物對高溫處理的反應不同，高溫處理對丹參花藥愈傷組織的誘導沒有促進作用。

通過對影響丹參花藥培養愈傷組織形成的各因子的研究，篩選出了各影響因子的最佳組合：將采摘花蕾經過4℃低溫預處理2 d，選取小孢子發育處于單核靠邊期的花藥為外植體，接種在MS+3％蔗糖+O.6％瓊脂+2.O mg／L 6－BA+O.2 mg／L NAA的培養基上，最有利于丹參花藥愈傷組織的誘導。