組織工程化犬氣管的生物力學研究

[摘要]目的:通過檢測不同方法處理的脫細胞犬氣管基質在無載荷及零應力狀態下的張開角和殘余應變，并對組織工程化氣管的力學性能進行初步探討。方法:取犬的第5～10氣管環，分別進行酶消化法和深低溫冷凍法處理，測量制成的脫細胞犬氣管基質與新鮮氣管在無載荷及零應力下的張開角及殘余應變。結果:新鮮犬氣管的張開角大于2組脫細胞犬氣管基質的張開角，其差異具有統計學意義。酶消化法脫細胞犬氣管基質的張開角及殘余應變大于深低溫冷凍組，其差異具有統計學意義。結論:不同方法脫細胞處理后，犬氣管的徑向支撐性能將受到影響，其中酶消化法構建的組織工程氣管基質抗壓縮能力優于冷凍法處理組的氣管基質。

[關鍵詞]組織工程;犬;氣管;生物力學;張開角

[中圖分類號]R318 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455(2010)07-1015-03

Biomechanical research of tissue engineered canine trachea

ZHANG Wen-hao1，HUO Ran1，LI Shang-bin2，YU Qing-ping3，ZHAO Yang1，GAO Feng1

(1.Department of Cosmetology and Plastic and Burn， Provincial Hospitial Affiliated to Shandong University，Jinan 250021，Shandong， China; 2.Department of Nuclear Medicine， Provincial Hospitial Affiliated to Shandong University; 3. Heze Municipal Hospital of Shandong Province)

Abstract:ObjectiveTo find the basic mechanical properties of tissue engineered trachea by detecting the opening angles and residual strains of acellular matrix of canine tracheas in the no-load and zero-stress states.Methods The 5th～10th tracheal rings below thyroid cartilage of canine were respectively treated with modified Courtman enzyme digest method and cryopreserved method. Then detect the opening angles and residual strains of these two acellular matrix groups and fresh trachea group in the no-load and zero-stress states.ResultsThe opening angles of fresh trachea group were larger than those two acellular matrix groups with statistical difference. The opening angles and residual strains of modified Courtman method group were larger than cryopreserved method group with statistical difference. ConclusionBoth modified Courtman method and cryopreserved method can influencethe radial sustain of canine tracheas， the tissue engineered acellular matrix treated with modified Courtman has a better anti- compressibility than cryopreserved tracheal acellular matrix.

Key words:tissue engineering; canine; trachea; biomechanics; opening angle

各種原因如創傷、腫瘤等引起的長段的氣管缺損，因吻合口張力過大而不能直接縫合時，需要用人工氣管來修復，其中組織工程化氣管因其在免疫排斥、材料來源等方面的優勢逐漸成為氣管重建外科的研究熱點。組織工程化氣管較為常用的去抗原方法有深低溫冷凍和酶消化法。本實驗主要探討這兩種方法處理后的脫細胞氣管基質的生物力學性能較新鮮氣管有無明顯變化，并推測氣管移植后的塌陷是否與處理方法的不同造成的力學性能變化有關。

Han[1]和Fung[2]指出零應力氣管扇形體雖然不是圓形的，但是利用扇形體內壁中點與內壁兩端點連線的夾角所定義的張開角依然可用來描述氣管扇形體的主要特征。我們采用Han 和Fung相同的方法取得犬氣管的無載荷狀態和零應力狀態。仔細檢測犬氣管無載荷狀態的內、外壁周長和零應力狀態的內、外壁弧長以及張開角，計算其殘余應變，將深低溫冷凍法和酶消化法犬脫細胞氣管基質與新鮮犬氣管的各項指標相比較，以研究其變化趨勢，為組織工程化氣管的進一步研究做力學方面的初步探討。

1材料和方法

將實驗用成年犬(雌雄不限)按30mg/kg靜脈注射3%戊巴比妥鈉生理鹽水溶液麻醉，切取頸段氣管甲狀軟骨下第5～10環氣管段，仔細剔除氣管外壁結締組織，4℃D-Hanks清洗保存備用，熱缺血時間少于15min。選取直徑及形態相近的氣管段，分別用于新鮮氣管測量、程控降溫冷凍保存、改良的Courtman方法[3]氣管黏膜脫細胞處理。

1.1 深低溫冷凍組處理方法

1.1.1冷凍保護劑成分:胎牛血清 20%、二甲基亞砜(DMSO)10%、青霉素50U/ml、鏈霉素50mg/ml。

1.1.2 冷凍方法:所取氣管段分別移入注滿冷凍保護劑的無菌生物冷凍管中，每管裝1個氣管段，使氣管段浸沒于冷凍保護液中，封口后置于4℃冰箱中冷平衡30min，應用程控降溫儀程序降溫，降溫速率為1℃/min，降至-80℃后取出，迅速放入-196℃的液氮中保存6周。測量前將冷凍管從液氮罐中取出，置入37℃恒溫水浴震蕩箱中，輕輕搖動，使氣管段均勻快速解凍復溫。

1.2 改良Courtman法氣管黏膜脫細胞組處理方法

1.2.1使用1%Triton X-100和2U/ml脫氧核糖核酸酶(DNAse)、1mg/L核糖核酸酶(RNAse)聯合順序作用于氣管組織，以脫去粘膜細胞。為防止蛋白酶對細胞外基質中的膠原成分產生破壞，在消化液中加入蛋白酶抑制劑(Aprotinin)和EDTA，抑制蛋白酶作用，保護膠原成分結構完整。配置消化液如下:A液:pH=8的Tris-Hcl緩沖液(1000ml含6.05g Tris堿，0.2gEDTA、10萬KIU Aprotinin);B液:pH=8的Tris-Hcl緩沖液(1000ml含6.05g Tris堿，87.7gNaCl、0.2gEDTA、10萬KIU Aprotinin);C液:pH=7.4的Tris-Hcl緩沖液(1000ml含10ml Triton X-100、0.2gEDTA、10萬KIU Aprotinin);D液:pH=7.6的Tris-Hcl緩沖液(1000ml含有DNAseⅠ2000U、RNAseA 1mg、MgCl21.22g、CaCl21.11g)。

1.2.2消化步驟如下:①加入消化液A，恒溫搖床4℃震蕩24h，每8h更換新的消化液;②加入消化液B，恒溫搖床4℃震蕩24h，每8h更換新的消化液;③4℃ D-Hanks震蕩洗滌4次，每次15min;④加入消化液C，恒溫搖床4℃震蕩24h，每8h更換新的消化液;⑤所取4℃D-Hanks震蕩洗滌4次，每次15min;⑥加入消化液D，恒溫搖床37℃震蕩4h;⑦加入消化液C，恒溫搖床4℃震蕩24h;⑧4℃ D-Hanks震蕩洗滌48h，4℃ D-Hanks內保存備用

1.3 氣管無載荷狀態的內、外壁周長以及零應力狀態的內、外壁弧長和張開角的測量方法:用著色筆分別標明氣管軟骨部分和肌肉部分的中點，垂直于氣管縱軸方向，將相鄰軟骨環之間的韌帶剪斷，使之成為無載荷狀態的獨立氣管環，按順序盛放在裝有生理鹽水的培養皿中，將培養皿放在掃描儀上直接掃描， 從而將無載荷狀態氣管環的幾何信息數字化存儲在計算機中。取得信息后，將氣管環自掃描儀上取下，從氣管環肌肉部分中點剪開，從而得到零應力狀態下氣管扇形體，將其放回培養皿中，靜置20min，待其形態穩定后，再放回掃描儀進行掃描，從而取得零應力狀態下氣管環的數字幾何信息(圖1)。最后，運用專用圖像分析軟件處理掃描所得圖像， 測得無載荷狀態氣管環和零應力狀態氣管扇形體的內、外壁弧長以及張開角等幾何尺寸。

1.4 統計分析:數據經SPSS13.0軟件包進行統計分析，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Q檢驗(Newman-kueuls法)。采用均數±標準差(x±s)來表示，P<0.05為有統計學意義。

2結果

2.1 形態學觀察:如圖1所示，分別為各組無載荷狀態下犬氣管環掃描圖像和各組零應力狀態下犬氣管扇形體掃描圖像。A組為新鮮氣管組，B組為深低溫冷凍組，C組為改良Courtman法氣管黏膜脫細胞組。其中圓弧部分為氣管環的軟骨，直線部分為肌肉部分。剪開前大體觀察可見各組樣本大小、形態相近，無明顯結構異常。

2.2 氣管的張開角:檢測各組犬氣管零應力狀態下扇形體，分別測量其內壁中點與兩端點連線所成的張開角。結果見表1。檢測數據采用均數±標準差(x±s)表示，組間兩兩比較采用Q檢驗。

結果(表2)示:新鮮氣管組張開角為103.632°±11.695°，深低溫冷凍法脫細胞組的張開角38.889°±11.814°，改良Courtman法脫細胞組張開角為72.332°±14.8258°，組間兩兩比較均有統計學差異(P<0.01)。由此可初步推斷，采用這兩種方法進行脫細胞處理對氣管的生物力學性能均會產生負面影響，而采用改良Courtman法進行脫細胞處理對氣管力學性能的負面影響較冷凍方法來講對小一些。

2.3氣管內外壁周長及其伸長比:測量各組犬氣管環及剪開后氣管扇形體，分別獲得無載荷狀態下氣管環內壁周長Ci、外壁周長Co，零應力狀態下氣管扇形體內壁弧長Li、外壁弧長Lo。檢測數據采用均數±標準差(x±s)來表示。計算出內、外壁伸長比為:λi=Ci/Li，λo= Co/Lo，(公式1)。由定義可得出在無載荷狀態下殘余應變(格林應變Green strain)的數學計算公式為Ei=(λi2-1)/2，Eo=(λo2-1)/2，(公式2)。

結果(表1)示:各組犬氣管內、外壁伸長比均大于1，即內外壁周長剪開后均有縮短，這與國內王憶勤[3]教授等對大鼠氣管測量結果(λi<1，λo>1)有所不同。對三組標本λi、λo進行方差分析，結果可認為各組間內、外壁伸長比(λi、λo)差異均有統計學意義(P<0.05)。進而進行三組之間兩兩比較，B組內、外壁伸長比均小于其余2組，且有統計學差異，而A、C組之間無統計學差異。由此結果可看出，在無載荷狀態下，三組犬氣管內外壁均處于拉伸狀態，且冷凍氣管組外壁拉伸比另外兩組均小，而新鮮氣管組與改良Courtman法脫細胞組的內外壁拉伸比并無統計學差異。

2.4 氣管的周向殘余應變:根據公式計算出各組氣管標本的殘余應變，并分別對內壁殘余應變Ei及外壁殘余應Eo行方差分析。結果(表2)示:各組均數不相等，差異有統計學意義(P<0.01)。組間兩兩比較顯示B組Ei 、Eo均小于另外兩組，且差異具有統計學意義(P<0.01)，而A、C兩組Ei、Eo差異均無統計學意義(P>0.05) 。據此推斷，經改良Courtman法脫細胞處理的氣管與新鮮氣管的徑向抗壓縮能力無顯著差異，而深低溫冷凍組氣管徑向抗壓縮能力小于其余兩組。

2.5張開角與殘余應變的關系:以上分別對張開角及殘余應變得分析可以看出，新鮮組氣管張開角比另外兩組脫細胞處理組大，不同方法脫細胞處理的兩組氣管基質之間張開角也有統計學差異，但經改良Courtman法脫細胞處理的氣管與新鮮氣管的內、外壁殘余應變并無統計學意義上的差異。從整體上來比較，張開角較大的氣管組其內、外壁殘余應變也較大，這個結果再一次印證了Fung關于張開角是殘余應變直觀表示的重要論斷，也與國內復旦大學柳兆榮、王憶勤[4]等對大鼠氣管測量所得結果相符合。

3討論

本次實驗又一次驗證了氣管在零載荷狀態下存在殘余應變，剪開后在殘余應力的作用下將形成具有一定張開角的扇形體[6]。與以往國內對大鼠氣管進行的實驗研究結果不同點在于，以往實驗結果顯示，大鼠氣管內壁伸長比小于1，內壁殘余應變小于0，即剪開前大鼠內壁氣管處于壓縮狀態，其內徑周長小于剪開后的內弧長[4]。而本次實驗結果發現所有三組犬氣管標本的內壁伸長比均大于1，即從整體上看，犬氣管內壁并未發現存在壓縮現象。滕忠照[5]等曾做過大鼠氣管兩次剪開的實驗，將大鼠氣管肌肉部分和軟骨部分分別剪開，發現除靠近氣管杈的氣管環外，大鼠氣管的肌肉內外壁均有位拉伸狀態。據此分析，由于犬氣管的直徑遠大于大鼠氣管，其肌肉部分彈性回縮很大程度上抵消掉了氣管軟骨部分的形變，所以在整體上計算，犬氣管內壁伸長比大于1。由于犬氣管與人體氣管大小更接近，這一結果將有助于對人氣管的力學性能的進一步研究。

Fung指出[6]，活組織生長取決于應力，在一定壓力載荷下，氣管將產生適應性生長，使其與所處的力學環境相適應，氣管張開角是殘余應變的直觀表示，可以用張開角來定量表示氣管的殘余應變[4]，并進一步推斷其徑向抗壓縮能力。從本次實驗結果可以看出，新鮮氣管的張開角明顯大于進行脫細胞處理后的兩組氣管基質。這說明將氣管進行脫細胞去抗原處理的過程中，各種物理及化學因素將對氣管的抗壓縮性能產生一定程度的不利影響。而本次實驗所采用的兩種脫細胞方法對氣管的抗壓縮性能產生的影響也不盡相同。以往對于氣管移植的研究主要集中在去抗原處理[7-10]上，而在處理過程中可能會造成氣管徑向抗壓縮能力下降并未引起人們過多重視，對于術后氣管的塌陷也大多從免疫反應及血液供應等方面考慮，對氣管本身支撐能力下降并未有明確研究，本實驗對不同方法處理后犬脫細胞氣管基質的支撐性能的初步研究，可望為以后組織工程化氣管的進一步研究提供力學方面參考。

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[收稿日期]2010-04-21 [修回日期]2010-06-25

編輯/張惠娟