胎兒頭皮毛囊內(nèi)黑素細(xì)胞HMB-45和NKI/beteb的表達(dá)

[摘要]目的:觀察黑素細(xì)胞在胎兒頭皮內(nèi)的定位。方法:獲取胎兒頭皮(胎齡7月，畸形引產(chǎn)，死亡2h)，制備冰凍切片，分別用HMB-45和NKI/beteb抗體進(jìn)行免疫熒光染色和免疫組化染色，激光共聚焦顯微鏡和倒置顯微鏡觀察攝片。結(jié)果:NKI/beteb陽(yáng)性細(xì)胞主要位于胎兒頭皮的毛囊外根鞘隆突區(qū)，也見(jiàn)于毛球處、表皮基底部。HMB-45陽(yáng)性細(xì)胞主要存在于毛球部、毛母質(zhì)和表皮基底部，外根鞘區(qū)表達(dá)則陰性。結(jié)論:胎兒頭皮毛囊內(nèi)存在不同狀態(tài)的黑素細(xì)胞，位于毛囊外根鞘隆突區(qū)的黑素細(xì)胞是黑素母細(xì)胞。

[關(guān)鍵詞]毛囊;胎兒;隆突;黑素細(xì)胞

[中圖分類號(hào)]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455(2010)07-1003-04

Location of melanocytes in hair follicle of fetal scalp

LI Hong-zhou，XUE Dong-zhang，ZHANG Ru-zhi，ZHU Wen-yuan，ZHANG Jing，CHEN Ze-nong，ZHAO Hao

(1. Department of Dermatology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Bengbu Medical University， Hefei 233004，Anhui，China)

Abstract:ObjectiveTo explore the location of melanocytes in hair follicle of fetal scalp. MethodsThe scalp was from a died fetus (fetal age of 7 months， induction delivery due to developmental abnormity ) and prepared for frozen sections， thenwhich respectively received immunofluorescent and immunofluochemical staining with HMB-45 and NKI/beteb antibodies. The stain results was observed and photographed by confocal microscope and the inverted microscope， respectively. ResultsThe positive cells stained by NKI/beteb antibody were mainly located at the bulge regions in the outer root sheath (ORS) of hair follicle， some in the hair bulbs and the epidermal basilar parts. The HMB-45 positive cells were present in the hair bulb， the hair matrix and the epidermal basilar parts， but not in ORS.ConclusionThere are melanocytes with different status in hair follicle. Melanocyte at the bulges of ORS is melanoblast.

Key words:hair follicle; fetus; bulge; melabocyte

毛囊是一個(gè)獨(dú)特的皮膚附屬器， 其色素單位的自我更新取決于毛囊內(nèi)的黑素干細(xì)胞(melanocyte stem cells， MSCs)及其子代細(xì)胞。毛囊MSCs特征如下:具備不成熟、慢循環(huán)、自我修復(fù)、產(chǎn)生子代細(xì)胞，并且活化增殖毛發(fā)生長(zhǎng)早期的細(xì)胞。毛囊黑素干細(xì)胞 (follicle melanocyte stem cells，F(xiàn)MSC)是MSCs中的一種。有報(bào)道鼠毛囊外隆突區(qū)檢測(cè)出MSCs[1]。鼠的胚胎研究顯示，F(xiàn)MSC存在于毛囊永久性區(qū)域的下部毛囊隆突區(qū)，具有MSCs的特征，受刺激后可以分化成為成熟的黑色素細(xì)胞[2]。因此，筆者設(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)初步定位人胎兒的FMC，觀察HMB45，NKI/beteb在人類胎兒毛囊中的表達(dá)情況。

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源:引產(chǎn)胎兒的頭皮(胎齡7月，畸形引產(chǎn))，取標(biāo)本時(shí)，胎兒已死亡2h。

1.1.2主要儀器及試劑:小鼠抗人HMB-45單克隆抗體(北京中山生物技術(shù)公司);小鼠抗人NKI/beteb單克隆抗體(Abcam);DyLightTM488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(北京中山生物技術(shù)公司)辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(北京中山生物技術(shù)公司);OLYPUS倒置顯微鏡;激光共聚焦顯微鏡(NIKON-EZ-C1SI)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本處理:獲取胎兒頭皮，用碘伏浸洗5min后，酒精去碘伏，接著生理鹽水沖洗數(shù)次，剪刀修剪組織標(biāo)本，去除脂肪，筋膜等多余組織，再用生理鹽水沖洗數(shù)次，最后多聚甲醛固定組織15min后，制備冰凍切片(4μm)，用冷丙酮固定15min。

1.2.2 共聚焦顯微鏡觀察:TBS+0.025%triton-100 溶液浸洗組織切片，5min/次，需2次，5%牛血清白蛋白室溫封閉15min。TBS+0.025%triton-100 溶液浸洗組織片，5min/次，需2次。分別加入一抗小鼠抗人HMB-45(1:100)，NKI/beteb(1:100)單克隆抗體孵育，4℃過(guò)夜。TBS+0.025%triton-100 溶液浸洗組織片3次，5min/次。暗室內(nèi)加免疫熒光二抗DyLightTM488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1:200)，37℃孵育，2h。TBS溶液浸洗組織片3次，5min/次。自然晾干。90%甘油封片。DyLightTM488-TFP熒光素是在Omnichrome氬-氪離子激光器的488nm處激發(fā)，515～565nm波段處濾過(guò)發(fā)射。激光共聚焦顯微鏡下觀察攝片。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察:PBS洗浸洗組織切片，0.3% Trito nX-100孵育，PBS洗，5%牛血清白蛋白封閉10min，分別加入一抗小鼠抗人HMB-45(1:100)，NKI/beteb(1:100)單克隆抗體孵育2h。PBS洗，加免疫組化二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG孵育30min。PBS洗，SP反應(yīng)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。倒置顯微鏡下觀察攝片。

2結(jié)果

2.1 激光共聚焦顯微鏡:激光共聚焦顯微鏡觀察NKI/beteb抗體免疫熒光標(biāo)記顯示，毛球部熒光強(qiáng)度高，呈簇集狀，沿毛球線形分布(圖1A)。在毛囊的橫斷面或斜切面上，熒光在毛囊周圍及其附近皮脂腺結(jié)構(gòu)處明顯，呈線狀勾勒出毛囊的切面的輪廓，在表皮基底部，熒光呈點(diǎn)線狀分布(圖1B)。在毛外根鞘中下段可以清楚的看到，均勻分布的熒光染色，放大后可見(jiàn)1～2個(gè)細(xì)胞聚集在一起(圖1C)。HMB-45抗體免疫熒光標(biāo)記顯示，在毛囊的縱切面上，熒光在毛漏斗部和毛球部處明顯，呈線狀勾勒出毛球的切面的輪廓;熒光在表皮基底均勻分布(圖1D)。在毛囊的橫切面上，熒光在毛囊周圍，皮脂腺周圍增強(qiáng)(圖1E)。根據(jù)外形推測(cè)這兩個(gè)毛囊，為休止期毛囊。其熒光最顯著處，推測(cè)是毛球底部、毛乳頭區(qū)(圖1F)。但是，熒光在毛囊外根鞘出沒(méi)有分布，這表明外根鞘細(xì)胞HMB-45表達(dá)陰性。

綜合以上觀察，在胎兒頭皮中NKI/beteb陽(yáng)性細(xì)胞大多分布于毛囊毛球部，毛漏斗部，皮脂腺，表皮基底部和毛囊外根鞘中下段。HMB-45陽(yáng)性的細(xì)胞大部分位于毛囊毛囊漏斗部，毛球部，皮脂腺和表皮基底部，而毛囊外根鞘上的細(xì)胞表達(dá)HMB-45呈陰性。

2.2 倒置顯微鏡觀察:倒置顯微鏡觀察NKI/beteb染色，顯示毛囊的斜切面，NKI/beteb染色陽(yáng)性的棕色顆粒，分布在毛球部及外根鞘中下部部位(圖2A)。在毛漏斗部及其周圍的皮脂腺也有陽(yáng)性細(xì)胞分布(圖2B)，進(jìn)一步放大倍數(shù)可以看到，在毛球部聚集陽(yáng)性細(xì)胞。這些陽(yáng)性細(xì)胞2～3個(gè)聚集，體積比較小，無(wú)明顯樹(shù)突，形態(tài)與其周邊的細(xì)胞相類似，但是其周邊細(xì)胞中無(wú)陽(yáng)性顆粒 (圖2C)。HMB-45染色，顯示陽(yáng)性細(xì)胞位于毛母質(zhì)(圖2D)，毛囊毛球部有陽(yáng)性細(xì)胞分布，呈棕褐色顆粒，簇集狀分布(圖2E);皮膚基底部也散在分布陽(yáng)性細(xì)胞，呈點(diǎn)狀線性分布(圖2F)。

綜合以上觀察，NKI/beteb抗體染色顯示，陽(yáng)性細(xì)胞分布在毛球，毛漏斗部及外根鞘，在外根鞘的中下段，有少數(shù)成群分布的被染成褐色的細(xì)胞，胞體較扁圓，無(wú)明顯樹(shù)突。HMB-45抗體染色顯示，在外毛根鞘上細(xì)胞均呈陰性，而在毛母質(zhì)區(qū)和毛球部為陽(yáng)性。

3討論

人黑素細(xì)胞起源于神經(jīng)嵴，在胚胎發(fā)育早期(2～5周)逐步向毛囊、表皮等處移行。在其移行過(guò)程中，有少數(shù)成黑素細(xì)胞在中途停滯或者開(kāi)始轉(zhuǎn)化成為無(wú)黑素合成活性并且未活化的黑素細(xì)胞(Amelanotic Melanocyte， AMMC)。早在1954年，Chase提出在毛囊上外跟鞘部存在一群細(xì)胞，它們不僅能夠再生毛囊，還可以再生皮脂腺和濾泡間上皮。在每個(gè)毛囊周期期間這些細(xì)胞導(dǎo)致毛囊皮脂腺單位的重塑。現(xiàn)在已知這種重塑由存在于毛囊內(nèi)的干細(xì)胞系控制。在人類毛囊中已經(jīng)鑒定出幾種類型的干細(xì)胞，包括表皮干細(xì)胞、間充質(zhì)樣干細(xì)胞[3-4]、黑素細(xì)胞干細(xì)胞[5]和巢蛋白陽(yáng)性干細(xì)胞[6-7]。已經(jīng)證實(shí)這些細(xì)胞在毛囊中既存在于不同微環(huán)境，又交錯(cuò)在一起。鼠黑素母細(xì)胞的分化增殖條件已被廣泛研究，研究者們認(rèn)為毛囊和皮膚的黑素細(xì)胞干細(xì)胞來(lái)源于這些細(xì)胞[8-9]。在毛囊外毛根鞘處可以分離和培養(yǎng)出AMMC[10]。在國(guó)內(nèi)外把從毛囊中分離和培養(yǎng)出的黑素細(xì)胞稱黑素母細(xì)胞[11]。盡管在鼠和人胚胎皮膚中確定并容易鑒定隆突，但是在成人毛囊中隆突并沒(méi)有形態(tài)學(xué)外觀[12]。所以人們?nèi)找鎸?duì)隆突干細(xì)胞特異性標(biāo)志物感興趣。

AMCC中的黑素小體發(fā)育不成熟，但在基因調(diào)控或外界刺激下，激活，增殖，且具有黑素化能力。NKI/beteb和HMB-45單克隆抗體都識(shí)別黑素小體上的膜分子蛋白-gp100，前者識(shí)別前黑素小體和成熟的黑素小體上的gp100，但后者只識(shí)別成熟的黑素小體上的gp100。這可能是由于這兩種抗體識(shí)別同一個(gè)分子不同的表位。所以，HMB-45單克隆抗體都不能單獨(dú)標(biāo)記出這類黑素細(xì)胞。然而可以借助NKI/beteb單克隆抗體等抗體的聯(lián)合來(lái)識(shí)別AMMC。

本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NKI/beteb陽(yáng)性細(xì)胞是位于外毛根鞘中下段，毛球部，毛漏斗部及其皮脂腺。但在HMB-45染色中，陽(yáng)性細(xì)胞在毛母質(zhì)，毛球部。外根鞘中沒(méi)有HMB-45陽(yáng)性細(xì)胞。因此筆者推測(cè)外毛根NKI/beteb陽(yáng)性染色的細(xì)胞就是AMMC，它們僅表達(dá)前黑素小體的相關(guān)抗原，卻不表達(dá)黑素小體的相關(guān)抗原以及黑素合成的相關(guān)酶蛋白。這些研究也表明，毛球部也有AMMC，其功能具有不成熟性。

黑素母細(xì)胞的研究，對(duì)于色素性疾病的防治有重要意義[13-14]。激活毛囊外黑素母細(xì)胞，促進(jìn)其移行到表皮，對(duì)白癜風(fēng)等色素減退性疾病的治療起著重要的作用;研究黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)因子，找到其中的關(guān)鍵因素，可以進(jìn)一步理解黑素瘤的形成和轉(zhuǎn)移。本次實(shí)驗(yàn)對(duì)進(jìn)一步研究分離黑素母細(xì)胞，促進(jìn)其增值分化，奠定一定的基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Nishimura EK，Jordan SA，Oshina H，et al. Dominant role of the niche in melanocyte stem-cell fatedetermination[J]. Nature，2002，416 (6883):854-860.

[2]Nishikawa S， Osawa M. Generating quiescent stem cells [J]. Pigment Cell Res，2007，20(4):263-270.

[3]Jahoda CAB. Cell movement in the hair follicle dermis-more than a two-way steet[J]. Inesting Dermatol，2003，121(6):1267-1275.

[4]Richardson GD， Arnott EC， Whitehouse CJ，et al. Plasticity of rodent and human hair follicle dermal cells: implications for cell therapy and tissue engineering [J]. Investing Dermatol Symp Proc，2005，10(3):180-183.

[5]Nishimura EK，Granter SR，F(xiàn)isher DE. Mechanisms of hair graying: incomplete melanocyte stem cell maintenance in the niche[J]. Science，2005，307(5710):720-724.

[6]Amoh Y，Li L，Campillo R，et al. Implanted hair follicle stem cells form Schwann cells that support repair of severed peripheral nerves[J]. Proc Natl Acad Sci，2005，102(49):17734-17738.

[7]Kruse C，Bodo E，Petschnik AE，et al. Towards the development of a pragmatic technique for isolating and differentiating nestin-positive cells form human scalp skin into neuronal and glial cell populations: generating neurons form human skin [J]. Exp Dermatol，2006，15(10)794-800.

[8]Hirobe T，F(xiàn)uruya R，Ifuku O，et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor is a keratinocyte-derived factor involved in regulating the proliferation and differentiation of neonatal mouse epidermal melanocytes in culture[J]. Exp Cell Res，2004，297(2):593-606.

[9]馬慧軍，朱文元，王大光，等.人頭皮毛囊外根鞘無(wú)色素黑素細(xì)胞的分離和純化培養(yǎng)進(jìn)一步研究[J].臨床皮膚科雜志，2004，33(2):76-79.

[10]Cook AL，Donatien PD，Smith AG，et al. Human melanoblasts in culture: expression of BRN2 and synergis tic regulation by fibroblast growth factor-2，stem cell factor，and endothelin-3[J]. J Invest Dermatol，2003，121(5):1150-1159.

[11]Lei TC，Vieira WD，Hearing VJ.In vitro migration of melanoblasts requires matrix metalloproteinase-2: implications to vitiligo therapy by photochemotherapy[J]. Pigment Cell Res，2002，15(6):426-432.

[12]Kloepper JE，Tiede S，Brinckmann J，et al. Immunophenotyping of the human bulge region: the quest to define useful in situ markers for human epithelial hair follicle stem cells and their niche[J]. Exp Dermatol，2008，17(7):592-609.

[13]張汝芝， 朱文元.毛囊內(nèi)黑素細(xì)胞研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，29(2):268-271.

[14]Nowak JA，Plolak L，Pasolli HA，et al. Hair follicle stem cells are specified and function in early skin morphogenesis[J]. Cell Stem Cell，2008，3(1):33-43.

[收稿日期]2010-04-20 [修回日期]2010-06-24

編輯/張惠娟