生物酶連續(xù)消化法對(duì)犬頸總動(dòng)脈脫細(xì)胞基質(zhì)材料生物力學(xué)的影響研究

[摘要]目的:探討利用生物酶連續(xù)消化法制備犬頸總動(dòng)脈脫細(xì)胞血管基質(zhì)時(shí)對(duì)材料生物力學(xué)的影響。方法:利用胰酶和核酸酶連續(xù)消化法制備犬頸總動(dòng)脈脫細(xì)胞血管基質(zhì)材料，通過組織學(xué)、掃描電鏡觀察和DNA含量的檢測，判斷細(xì)胞的脫除情況;檢測脫細(xì)胞材料的拉伸強(qiáng)度、爆裂強(qiáng)度及順應(yīng)性，判斷脫細(xì)胞過程對(duì)材料生物力學(xué)性質(zhì)的影響。結(jié)果:組織學(xué)染色及掃描電鏡的結(jié)果表明血管細(xì)胞成分被完全去除，血管細(xì)胞外基質(zhì)成分保留完整;與新鮮犬頸總動(dòng)脈相比，脫細(xì)胞材料的拉伸強(qiáng)度和爆裂強(qiáng)度沒有明顯的改變，而材料的順應(yīng)性有所降低。結(jié)論:生物酶連續(xù)消化法制備的犬頸總動(dòng)脈脫細(xì)胞基質(zhì)材料保持了與新鮮血管大部分生物力學(xué)性質(zhì)，但材料的順應(yīng)性有所降低。

[關(guān)鍵詞]血管;組織工程;細(xì)胞外基質(zhì);生物力學(xué)

[中圖分類號(hào)]R318[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455(2010)07-0996-04

Effects of decellularization using biotic enzymes on the mechanical properties of the canine carotid artery

LIU Guo-feng1，HE Zhi-juan2，YANG Da-ping1，XU Xue-wu1，LIU Ying1，REN Li-hong1，LI Qing-chun1

(1.Department of Plastic Surgery，Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150086，Heilongjiang，China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 15001 0，Heilongjiang，China)

Abstract:ObjectiveThe objective of this study is to investigate the effects of decellularization using biotic enzymes on the mechanical and structural properties of the canine carotid artery.MethodsIntact canine carotid artery were decellularized by using Trypsin/EDTA，ribonuclease and desoxyribonuclease. Residual cellular and extracellular matrix composition was evaluated with hematoxylin and eosin (HE) staining，quantitative DNA analysis and scanning electron microscopy. Tensile strength， burst strength and compliance were measured in vitro to determine the effects of decellularizedprocess on the biomechanical properties of the canine carotid artery.ResultsHistology and scanning electron microscopy examination demonstrate that scaffolds were completely decellularized and scaffolds revealed a well-preserved extracellular matrix. Compared with fresh canine carotid artery， decellularized artery had similar burst and breaking strength and had lower compliance.Conclusion This study demonstrates that the decellularized artery using biotic enzymes had similar burst and breaking strength and had lower compliance compared with fresh canine carotid artery.

Key words: vascular grafts; tissue engineering; extracellular matrix; biomechanical

血管組織工程學(xué)研究為臨床上小口徑血管移植物的制備提供了光明的前景，口徑小于6mm的小口徑組織工程血管研究與大口徑血管移植物的研究有很大的差別[1]。因?yàn)檠芤浦参锱c受區(qū)血管生物力學(xué)性質(zhì)的匹配程度對(duì)不同口徑的組織工程血管移植物通暢率的影響差別較大，血管移植物的口徑越小受到的影響越大，小口徑血管移植物在受體內(nèi)更容易發(fā)生內(nèi)膜增生、中膜增厚，最后導(dǎo)致移植物的官腔狹窄甚至閉塞[2]。血管組織工程研究中支架材料的力學(xué)性質(zhì)對(duì)血管移植物的生物力學(xué)性質(zhì)起著決定性的作用，所以在小口徑組織工程工程血管的研究中制備與受區(qū)血管生物力學(xué)性質(zhì)完全匹配的支架材料是最關(guān)鍵的科學(xué)問題，這將決定小口徑組織工程血管移植的遠(yuǎn)期通暢率[3]。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)小口徑組織工程血管脫細(xì)胞基質(zhì)生物支架材料的生物力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，明確生物酶聯(lián)合消化法對(duì)犬頸總動(dòng)脈脫細(xì)胞基質(zhì)材料生物力學(xué)的影響。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物:普通雜種家犬，體重25～30kg，6個(gè)月齡，雌雄不限。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料及主要儀器:胰蛋白酶(Trypsin)、核糖核酸酶(Ribonuclease，RNase)、脫氧核糖核酸酶(Desoxyribonu clease，DNase):美國Sigma公司;EDTA(Ethylenediamine tetraacetic acid)、磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer solution，PBS):北京中杉生物公司;普通光學(xué)顯微鏡:日本Nikon公司;S-3400N型掃描電子顯微鏡:日本Hitachi公司;電子萬能實(shí)驗(yàn)材料機(jī):德國Zwick-Roell公司。

1.3 犬頸總動(dòng)脈脫細(xì)胞基質(zhì)材料制備: 無菌條件下切取犬頸總動(dòng)脈，大量無菌PBS沖洗，去除血液成分及外層附屬軟組織，選擇切取長度約為7cm，內(nèi)徑約為3mm的動(dòng)脈，利用胰蛋白酶和核酸酶連續(xù)消化法去除動(dòng)脈細(xì)胞及其碎片成分[4]。先用0.1% 胰蛋白酶加0.02% EDTA 溶液消化20h，中間更換1次消化液，大量PBS沖洗后用20μg/ml RNase +200μg/ml DNase溶液消化2h，大量無菌PBS 溶液沖洗。以上步驟均在5%CO2、37℃，80次/ min持續(xù)震蕩條件下進(jìn)行。監(jiān)測制備的脫細(xì)胞血管基質(zhì)，使材料的細(xì)胞DNA殘留量少于0.1%。同時(shí)選取新鮮犬頸總動(dòng)脈作為對(duì)照組(每組6例)，進(jìn)行以下檢測。

1.3 組織學(xué)染色 將標(biāo)本置于10%中性甲醛溶液中固定24h，常規(guī)石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE染色。在普通光學(xué)顯微鏡下對(duì)標(biāo)本的結(jié)構(gòu)進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)照相。

1.4 掃描電鏡觀察 將標(biāo)本在1%戊二醛溶液中固定24h以上，用1%餓酸作后固定2h，50%、70%、90%、100%丙酮梯度脫水，50%、70%、90%、100%醋酸異戊酷置換，應(yīng)用臨界點(diǎn)干燥儀、液體C02等進(jìn)行干燥;干燥的標(biāo)本固定在鋁質(zhì)標(biāo)本臺(tái)上，用濺射鍍膜機(jī)鍍金后，用S-3400N型掃描電子顯微鏡系統(tǒng)觀察并照相。

1.5 生物力學(xué)檢測:利用Zwick/Roell Z010型電子萬能力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)測定標(biāo)本的拉伸強(qiáng)度、爆裂強(qiáng)度及軸向順應(yīng)性。拉伸強(qiáng)度及軸向順應(yīng)性檢測:將管狀標(biāo)本(長度為5cm)兩端固定于微型夾具上，以0.5mm/s的速度拉伸，直至標(biāo)本斷裂，系統(tǒng)自動(dòng)記錄標(biāo)本的應(yīng)力-應(yīng)變曲線及極限拉伸強(qiáng)度，計(jì)算出標(biāo)本的軸向順應(yīng)性。爆裂強(qiáng)度檢測:把管狀標(biāo)本一端用絲線結(jié)扎，另一端固定于裝滿生理鹽水的5ml醫(yī)用注射器上，注射器筒壁固定于250ml玻璃葡萄糖瓶中，整個(gè)裝置平置在力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)上，以40kPa/s的力向標(biāo)本內(nèi)注射生理鹽水，直至標(biāo)本爆裂或漏液，系統(tǒng)自動(dòng)記錄標(biāo)本的爆裂強(qiáng)度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析: 所有定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用x±s表示，利用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1大體所見:犬頸總動(dòng)脈脫細(xì)胞基質(zhì)材料仍保持新鮮血管的管狀結(jié)構(gòu)，血管的長度及內(nèi)徑無明顯改變，材料外觀呈乳白色(圖1)。

2.2 組織學(xué)結(jié)構(gòu):新鮮犬頸總動(dòng)脈具有血管典型的三層結(jié)構(gòu):內(nèi)膜、中膜及外膜，中膜層較厚，包含大量的環(huán)狀排列藍(lán)染的細(xì)胞核成分和細(xì)胞外基質(zhì)成分(圖2A)。經(jīng)脫細(xì)胞處理后，血管壁中的藍(lán)染的細(xì)胞核成分全部去除，但脫細(xì)胞血管的細(xì)胞外基質(zhì)中纖維成分保存完整連續(xù)，沒有發(fā)生斷裂破碎等。血管的中膜層結(jié)構(gòu)中可見細(xì)胞及部分細(xì)胞外基質(zhì)去除后遺留的空隙，同時(shí)血管內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外基質(zhì)成分保持完好(圖2B)。

2.3 掃描電鏡觀察:脫細(xì)胞犬頸總動(dòng)脈脫細(xì)胞基質(zhì)橫斷面的掃描電鏡照片可見大致的三層細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，內(nèi)層見完整致密的內(nèi)彈性膜，中層可見成層環(huán)狀排列的纖維板層結(jié)構(gòu)，纖維連續(xù)，可見梭形空隙，材料外層可見雜亂排列的外膜層纖維條索組織(圖3A)。材料內(nèi)表面掃描電鏡照片顯示，材料的內(nèi)彈性膜纖細(xì)的纖維呈網(wǎng)狀分布，纖維完整，未見明顯斷裂缺失，透過纖維網(wǎng)可見深部中膜層較粗大的纖維(圖3B)。

2.4 生物力學(xué)性質(zhì):爆裂強(qiáng)度檢測結(jié)果如下，脫細(xì)胞犬頸總動(dòng)脈基質(zhì)組為315.00±12.49 KPa，新鮮犬頸總動(dòng)脈組為330.52±18.73 KPa，兩組標(biāo)本爆裂強(qiáng)度相似，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖4)。極限拉伸強(qiáng)度檢測結(jié)果如下:脫細(xì)胞犬頸總動(dòng)脈基質(zhì)組為4 122.91±118.05 KPa，新鮮犬頸總動(dòng)脈組為4 212.99±103.80 KPa，兩組標(biāo)本極限拉伸強(qiáng)度相似，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。軸向順應(yīng)性計(jì)算結(jié)果如下，脫細(xì)胞犬頸總動(dòng)脈基質(zhì)組為0.945±0.158 mm/mm，新鮮犬頸總動(dòng)脈組為1.195±0.22 mm/mm，脫細(xì)胞犬頸總動(dòng)脈基質(zhì)組軸向順應(yīng)性低于新鮮犬頸總動(dòng)脈組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5)。

3討論

具有三維空間結(jié)構(gòu)的支架材料是構(gòu)建組織工程血管的基本要素之一，能為血管種子細(xì)胞生長和組織發(fā)育提供臨時(shí)的支撐骨架，并能夠調(diào)控所構(gòu)建血管的形態(tài)。研制和開發(fā)理想的支架材料仍然是血管組織工程所面臨的巨大挑戰(zhàn)。為了克服可降解高分子聚合物材料在生物相容性方面的不足，很多學(xué)者把研究目光轉(zhuǎn)移到了自然來源的生物支架材料上[5]。自然生物材料具有良好的生物相容性，能夠促進(jìn)細(xì)胞的黏附、生長、增殖及生物功能的發(fā)揮。血管組織工程支架材料的發(fā)展趨勢是自然生物材料的應(yīng)用，自然生物材料是最有應(yīng)用潛力的組織工程支架材料來源[6]。血管脫細(xì)胞基質(zhì)材料的三維空間結(jié)構(gòu)與自然血管的結(jié)構(gòu)非常類似，因此具有理想的外形和適當(dāng)?shù)纳锪W(xué)性質(zhì)，是血管組織工程學(xué)研究中較為理想的生物支架材料[7]。

正常血管的細(xì)胞外基質(zhì)成分包含膠原纖維、彈性蛋白及蛋白聚糖等成分，膠原纖維及彈性蛋白對(duì)于血管的強(qiáng)度起關(guān)鍵性的作用。膠原纖維具有良好的抗張強(qiáng)度，對(duì)于維持血管的完整性具有重要意義，彈性蛋白和蛋白聚糖有一定的彈性，能夠使血管具有良好的順應(yīng)性[8]。研究表明，脫細(xì)胞處理會(huì)改變血管原有的生物力學(xué)性質(zhì)，特別是材料的順應(yīng)性常會(huì)降低[9]。本實(shí)驗(yàn)利用生物酶連續(xù)消化法制備的犬頸總動(dòng)脈脫細(xì)胞基質(zhì)材料在去除了細(xì)胞及DNA殘留物的同時(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)的纖維成分保持完整連續(xù)，所以脫細(xì)胞材料的拉伸強(qiáng)度和爆裂強(qiáng)度與新鮮血管相似。除膠原纖維和彈性蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)纖維成分外，蛋白聚糖成分在脫細(xì)胞處理過程中常會(huì)遭到破壞，蛋白聚糖的去除對(duì)于脫細(xì)胞血管的拉伸強(qiáng)度和爆裂強(qiáng)度沒有明顯的影響，但會(huì)使材料的彈性降低變硬，生物力學(xué)的表現(xiàn)是材料的順應(yīng)性下降[10]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，經(jīng)過生物酶連續(xù)消化脫細(xì)胞處理，脫細(xì)胞犬頸總動(dòng)脈基質(zhì)材料的軸向順應(yīng)性有所降低，從組織學(xué)觀察可以看出，脫細(xì)胞后血管橫斷面膠原纖維和彈性蛋白等纖維條索中間出現(xiàn)很多梭形空隙，這些空隙是由于中膜內(nèi)平滑肌細(xì)胞及蛋白聚糖的去除而形成的，因此，脫細(xì)胞犬頸總動(dòng)脈的軸向順應(yīng)性與新鮮血管相比有所降低。

組織工程血管的拉伸強(qiáng)度、爆裂強(qiáng)度的順應(yīng)性是重要的生物力學(xué)力學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)，足夠的拉伸強(qiáng)度和爆裂強(qiáng)度能夠保證血管移植后能夠抵抗長期的血液動(dòng)力學(xué)作用而不形成動(dòng)脈瘤。而對(duì)于小口徑組織工程血管移植物，順應(yīng)性與拉伸強(qiáng)度和爆裂強(qiáng)度相比顯得更為重要，小口徑血管移植物和受區(qū)血管之間的順應(yīng)性要匹配，這是移植物長期成功的重要保證[11-12]。血管移植物與受區(qū)血管之間的順應(yīng)性等力學(xué)性質(zhì)錯(cuò)配會(huì)導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)的變化，血流方向改變、剪切力增加、下游血流紊亂、循環(huán)張力改變，從而引起吻合口處的應(yīng)力集中，刺激內(nèi)膜增生的生長因子的釋放增加，促進(jìn)了血栓的形成和新內(nèi)膜的增生，最終導(dǎo)致血管移植物長期通暢率明顯降低[13-14]。脫細(xì)胞處理經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致血管細(xì)胞外基質(zhì)材料順應(yīng)性的降低，從而影響構(gòu)建的小口徑組織工程血管與受區(qū)血管生物力學(xué)性質(zhì)的匹配，導(dǎo)致移植失敗，所以提高以脫細(xì)胞血管基質(zhì)為支架材料的小口徑組織工程血管的順應(yīng)性是組織工程血管研究的瓶頸問題。可能的解決方案包括:(1)改進(jìn)完善脫細(xì)胞血管基質(zhì)材料的制備方法，在保證血管細(xì)胞成分完全去除的前提下盡量保留細(xì)胞外基質(zhì)材料原有的生物力學(xué)性質(zhì);(2)通過在脫細(xì)胞血管基質(zhì)材料上復(fù)合某種其他材料制備順應(yīng)性良好的復(fù)合支架材料;(3)在體外利用脫細(xì)胞血管支架材料構(gòu)建組織工程血管的過程中促使平滑肌細(xì)胞分泌大量新生細(xì)胞外基質(zhì)成分，以增加組織工程血管的順應(yīng)性。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Isenberg BC，Williams C，Tranquillo RT.Small-diameter artificial arteries engineered in vitro[J]. Circ Res，2006，98(1):25-35.

[2]Wang X，Lin P，Yao Q，et al. Development of small-diameter vascular grafts[J]. World J Surg，2007，31(4):682-689.

[3]Tiwari A，Cheng KS，Salacinski H，et al. Improving the patency of vascular bypass grafts: the role of suture materials and surgical techniques on reducing anastomotic compliance mismatch[J]. Eur J Vasc Endovasc Surg，2003，25(4):287-295.

[4]劉國鋒，楊大平，郭鐵芳，等. 小口徑組織工程血管脫細(xì)胞生物支架材料的研究[J]. 中國康復(fù)理論與實(shí)踐，2008，14(3): 234-236，301.

[5]Stegemann JP，Kaszuba SN，Rowe SL. Review: advances in vascular tissue engineering using protein-based biomaterials[J]. Tissue Eng，2007，13(11):2601-2613.

[6]Meredith JE Jr，F(xiàn)azeli B，Schwartz MA. The extracellular matrix as a cell survival factor[J]. Mol Biol Cell，1993，4(9): 953-961.

[7]Schmidt CE，Baier JM. Acellular vascular tissues: natural biomaterials for tissue repair and tissue engineering[J]. Biomaterials，2000，21(22):2215-2231.

[8]MacNeill BD，Pomerantseva I，Lowe HC，et al. Toward a new blood vessel[J]. Vasc Med，2002，7(3):241-246.

[9]Amiel GE， Komura M，Shapira O，et al. Engineering of blood vessels from acellular collagen matrices coated with human endothelial cells[J]. Tissue Eng，2006，12(8):2355-2365.

[10]Courtman DW， Pereira CA， Kashef V. Development of a pericardial acellular matrix biomaterial: biochemical and mechanical effects of cell extraction[J]. J Biomed Mater Res，1994，28:655-666.

[11]Ballyk PD， Walsh C， Butany J，et al. Compliance mismatch may promote graft-artery intimal hyperplasia by altering suture-line stresses[J]. J Biomech， 1998，31(3):229-237.

[12]Abbott WM， Megerman J，Hasson JE，et al. Effect of compliance mismatch on vascular graft patency[J]. J Vasc Surg，1987，5(2):376-382.

[13]Howard AB，Alexander RW，Nerem RM，et al. Cyclic strain induces an oxidative stress in endothelial cells[J]. Am J Physiol，1997，272(2 Pt 1):C421-427.

[14]Trubel W，Moritz A，Schima H，et al. Compliance and formation of distal anastomotic intimal hyperplasia in Dacron mesh tube constricted veins used as arterial bypass grafts[J]. Asaio J，1994，40(3):M273-278.

[收稿日期]2010-05-25[修回日期]2010-07-10

編輯/張惠娟