TGF-β1受體阻滯劑對樹突狀細胞融合疫苗制備的影響研究

[摘要] 目的 探討TGF-β1受體阻滯劑SB-431542對樹突狀細胞(DC)融合疫苗制備的影響。方法 ①SB-431542(TGF-β1受體阻滯劑)與粒細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細胞介素-4(IL-4)、脂多糖(LPS)聯合應用，刺激C57BL/6小鼠骨髓來源DC成熟，應用聚乙二醇(PEG)融合技術融合DC和小鼠胰腺癌細胞(Panc02)，制備融合疫苗。②觀察細胞形態、細胞表面表達、MTT法檢測腫瘤細胞體外殺傷細胞毒活性。結果 ①在SB-431542參與下，成熟DC的細胞數目及形態無顯著改變;②DC表面CD80、CD86、CD40的表達較未加SB-431542顯著增高;MTT比色法，添加SB-431542的DC疫苗組對腫瘤細胞的殺傷抑制率顯著提高。結論 SB-431542組融合細胞的分子表達較非SB-431542組顯著提高;體外MTT顯示SB-431542組有更好的抗腫瘤效應，說明SB-431542對增強融合疫苗抗腫瘤效應有明顯的增強作用。

[關鍵詞] 樹突狀細胞;細胞融合;SB-431542;腫瘤疫苗

[中圖分類號] R392.33 [文獻標識碼] A[文章編號] 1673-9701(2010)14-17-03

Effect of TGF-β1Receptor Blocker on Fusion Vaccine of Dendritic Cells

REN Jianlin1XU Jun2

1. Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China;2. Department of General Surgery，Shanxi Provincial People's Hospital，Taiyuan 030012，China

[Abstract] Objective To investigate the effect of SB-431542 on the preparation of the dendritic cell fusion vaccine. Methods ①In the presence of SB-431542(an inhibitor TGF-β1 receptor)，GM-CSF，IL-4 and LPS，the maturation of dendritic cells from C57BL/6 mouse bone marrow was stimulated，and the preparation of the fusion vaccine was made by use of polyethylene glycol(PEG) fusion technique for fusion of DC and mouse pancreatic cells(Panc02). ②The observation of cell morphology and expression of cell surface phenotypes and the MTT assay detection of specific cytotoxic Tlymphocyte(CTL) were carried out. Results ①SB-431542 could stimulate the full maturation of dendritic cells. Dendritic cells and panc02 cells could be fused by PEG. ②The fusion cells exhibited typical biological characteristics. The expression of cell surface phenotypes was enhanced efficiently. Conclusion SB-431542 can enhance the maturation of dendritic cell. The fusion vaccine could induce a specific and effective immune response against tumor cell.

[Key words] Dendritic cells;Cell fusion;SB-431542;Cancer vaccine

絕大多數腫瘤缺乏特異性抗原，而且腫瘤組織中抗原提呈細胞數量減少、功能低下或缺如。因此應用細胞融合技術將腫瘤細胞和DC融合，融合細胞即包含腫瘤細胞表面的所有抗原，又具有DC的強大的抗原提呈能力和刺激效應細胞免疫能力[1-2]。

轉化生長因子-β(TGF-β)超家族生長分化因子是一種具有多功能生物學活性的細胞因子，在調節細胞的生長、分化、凋亡、炎癥反應及纖維化中起著重要的作用。Smads蛋白是TGF-β唯一的作用底物，能將TGF-β信號從細胞外傳遞到細胞核的中介分子，是該信號通路中的關鍵步驟[3]。

我們將SB-431542加入DC后與panc02融合，來觀察其細胞表型的表達及其體外抗腫瘤效應。

1材料和方法

1.1材料和試劑

C57BL/6小鼠購自華西醫科大學，小鼠胰腺癌細胞株(panc02)購于上海滬峰生物有限公司，SB-431542﹑重組粒細胞集落刺激因子(GM-CSF)、重組白細胞介素4(IL-4)、FITC- CD80、FITC-CD86、FITC-CD40、聚乙烯二醇(PEG)、HAT/HT培樣液均購自Sigma公司

1.2C57BL/6小鼠的來源與主要特性

1.2.1來源1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57號與雄鼠52號交配而得C57BL1937年從C57BL分離出C57BL/6和C57BL/10兩個亞系。1985年從Olac引進到中國醫學科學院實驗動物研究所。

1.2.2主要特性①乳腺腫瘤自然發生率低，化學物質難以誘發乳腺和卵巢腫瘤。②12%有眼睛缺損;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%為小眼或無眼。用可的松可誘發腭裂，其發生率達20%。③對放射物質耐受力中等;補體活性高;較易誘發免疫耐受性。④對結核桿菌敏感。對鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干擾素產量較高。⑥嗜酒精性高，腎上腺素類脂質濃度低。對百日咳組織胺易感因子敏感。⑦常被認作\"標準\"的近交系，為許多突變基因提供遺傳背景。其主要特點為近交系小鼠，試驗結果精度高，可比性好，應激反應均一。

1.3DC的制備[4]

取3只C57BL/6小鼠，頸椎脫臼法處死，在無菌條件下剝離股骨，用DMEM培養液沖洗骨髓腔，沖洗骨髓腔變白，獲取骨髓細胞混合懸液，離心去掉上清液，淋巴細胞分離液(按與樣本體積1∶3混合)梯度離心15～20min，吸取中間白膜層細胞，調細胞濃度為(2×106)個/mL，培養2h后去除懸浮細胞，加入含IL-4(50~100)ng/mL、GM-CSF(100~150)ng/mL的完全培養基，3d半量換液，補加細胞因子。第6天加入LPS和SB-431542(10mmol/L)，不加SB-431542作為對照，第7天收獲DC。

1.4融合疫苗的制備[5]

取生長良好的panc02與DC，調節細胞濃度分別為1×107/mL和1×106/mL，將其按panc02∶DC=10∶1混合離心洗滌棄上清，加入1mL PEG(50%，在37℃水浴中預溫)，輕吹，使兩種細胞均勻混合，加入9mL DMEM培養液終止細胞的融合反應，離心洗滌棄上清，在DMEM完全培養液(10%胎牛血清)培養1d，14d后更換HAT培養液，再7d后更換HT培養液，獲取純凈的融合細胞。

1.5細胞表型的檢測

取未經SB-431542和經SB-431542培養的融合細胞用熒光素標記抗體，流式細胞儀檢測其CD80、CD86、CD40的表達。

1.6觀察細胞形態

取DC、非SB-431542組和添加SB-431542組，調節細胞濃度分別為2.5×104/mL、1.5×106/mL、1.4×106/mL，接種于6孔板中，5%CO2孵箱中培養7d，觀察細胞形態。

1.7淋巴細胞懸液的制備

取C57BL/6小鼠斷頭處死，取脾臟碾磨過200目濾膜，制成單細胞懸液，再用淋巴細胞分離液分離混合淋巴細胞，DMEM培養液洗2次，5% CO2培養4h，即為效應細胞。

1.8腫瘤細胞的體外殺傷作用

將效應細胞與SB-431542組融合，非SB-431542組按1∶1均勻混合細胞、5%CO2的孵箱靜置培養觀察3d;培養結束后將細胞濃度調整為2×105/mL，加入含(2×104/孔)的96孔板，5%CO2孵箱靜置培養觀察2d;每孔加入5mg/mL MTT各40μL，4h后采取一次翻轉法棄掉MTT，然后每孔各加入100μL DMSO，將培養板置于微孔板振蕩器上振蕩10min，使結晶物充分溶解，酶聯免疫檢測儀測定光吸收值(A)，測定波長570nm、參考波長630nm，空白培養液為對照。按下列公式計算各組對panc02的殺傷率。腫瘤細胞抑制率=(對照孔平均A -實驗孔平均A)×100%/對照孔平均A

A570-630 =A570-A630

1.9統計學方法

所得數據以均數±標準差(χ±s)表示，采用兩組獨立樣本t檢驗SPSS13.0統計軟件進行分析，P<0.05認為差異有顯著性。

2結果

2.1培養細胞的形態觀察

新分離的DCs，呈圓形，胞體小:見封三圖1;培養第3天胞體圓，有少許突起:見封三圖2;加LPS刺激后，培養第7天，樹突狀突起明顯，出現典型的DCs形態:見封三圖3。倒置顯微鏡下觀察可見融合細胞體積增大，細胞呈懸浮生長，細胞形態不規則，多呈圓形，每個DC可融合多枚panc02，融合數值及比例均未見規律性，有少許未融合的DC，體積較小。

2.2細胞表型的檢測

經SB-431542培養與未經SB-431542培養的融合細胞組比較，細胞表面的表型的表達顯著提高(P<0.01)。見表1。

2.3融合疫苗對panc02體外殺傷作用

SB-431542組激活效應細胞對panc02的殺傷率(73.54±5.70)%，非SB-431542組對panc02的殺傷率(31.23±1.93)%，單純效應細胞對panc02的殺傷率(20.15±2.65)%。融合疫苗組對panc02殺傷作用與效應細胞比較有顯著差異(P<0.01)，SB- 431542組與非SB-431542組對panc02的殺傷作用比較有顯著差異(P<0.01)。

3討論

近年來應用細胞融合技術將腫瘤細胞和DC融合，已經成為腫瘤免疫治療研究的熱點，國外學者多采用腫瘤細胞與DC經電穿孔途徑融合，觀察到DC刺激后續抗腫瘤免疫反應的能力明顯增強[6]。國內張坤等[7]成功將通過PEG將DC與胃癌細胞融合，結果表明融合細胞有很好的抗腫瘤效應，孫正[8]等將DC與結腸癌細胞融合，體外實驗證明有很好殺傷癌細胞效應。

panc02是來源于C57BL/6小鼠的胰腺導管癌細胞株，已證實panc02接種皮下有很強的致癌能力，并且對臨床抗癌藥有很高的抵抗力，同時也能高表達TGF-β1[9]。SB-431542是一種小分子TGF-β1受體阻滯劑，對融合細胞的生長、分化、增殖不產生明顯影響，它可以阻斷Smads的磷酸化及核轉移，通過轉錄水平降低TGF-β1的表達，也可通過抑制TGF-β1的轉移浸潤，實驗證明SB-431542同時也能提高免疫效應細胞的IFN-γ的表達，降低IL-10的表達，抑制血管內皮細胞生長因子及纖維蛋白溶酶原的表達發揮生物學效應，從而具有抗腫瘤免疫作用[10，11]。本實驗中，我們發現SB-431542作用于DC融合細胞的培養，融合細胞增殖不明顯，細胞數量穩定，流式細胞儀檢測融合細胞表面CD80、CD86、CD40較對照組明顯升高。

在本部分實驗中，我們將胰腺癌細胞、DC通過PEG誘導進行融合，經HAT/HT選擇培養系統篩選培養后獲得純凈融合細胞，并對融合細胞進行流式細胞儀細胞表型檢測。結果提示，加入SB-431542后，融合細胞的細胞表型表達水平顯著提高，并且體外實驗也表明有很好的抗腫瘤效應。但是，未加入SB-431542對DC疫苗抗腫瘤作用不明顯，這與國外的研究結果相似[12]，可能是panc02高表達的TGF-β1對DC的作用，其進一步機制尚待實驗研究，本實驗證實SB-431542作用DC融合疫苗是抗腫瘤的一種有效的手段。

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(收稿日期:2010-03-22)