Claudin-1基因在大腸癌中表達檢測的意義

[摘要] 目的 探討Claudin-1基因mRNA在大腸癌發病過程的表達及意義。方法 收集62例液氮保存的新鮮大腸癌組織及其對應的正常大腸組織，常規方法提取組織總RNA。將這些總RNA逆轉錄成cDNA后，利用實時熒光定量PCR方法檢測Claudin-1基因在這些組織中的表達情況，最后統計分析Claudin-1表達變化與大腸癌進展相關的臨床病理參數之間的關系。結果 與正常大腸組織相比，Claudin-1基因在大腸癌組織中表達明顯增強，此外，DukesⅢ、Ⅳ期大腸癌患者Claudin-1基因表達比Ⅰ、Ⅱ期患者明顯增強。結論 Claudin-1基因在大腸癌中高表達，提示其可能與大腸癌發生和進展過程有關。

[關鍵詞] 大腸癌;Claudin-1;實時熒光定量PCR

[中圖分類號] R735.3+4[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-9701(2010)14-15-03

Detection of Claudin-1 mRNA Expression in Large Intestine Cancer

HU Jingping

Gastroenterology，Yongzhou City People's Hospital，Yongzhou 425000，China

[Abstract] Objective To explore the expression change of Claudin-1 mRNA and its significance in the pathogenesis of large intestine cancer. Methods Total RNA of 62 fresh large intestine cancer samples and their corresponding normal samples was extracted by routine Trizol way. After total RNA reverse transcription into cDNA，the Claudin-1 gene expression in these samples was detected by real-time PCR. Finally，the correlation of Claudin-1 expression with clinical patho-parameters was analyzed in large intestine cancer. Results Compared with the normal samples，the Claudin-1 expression was markedly increased in large intestine cancer samples. In addition，the Claudin-1 expression in large intestine cancer samples of Dukes Ⅲ and Ⅳ phases was obvious higher than that in Dukes ⅠandⅡ phases. Conclusion Over expressed Claudin-1 may promote the pathogenesis of large intestine cancer.

[Key words] Large intestine cancer;Claudin-1;Real-time PCR

大腸癌是目前包括中國在內國際上最常見的惡性腫瘤，其發生、發展受到遺傳、環境以及飲食結構等眾多因素影響，出現一些重要基因表達變異，最終導致腫瘤發生。

Claudin蛋白家族包括24個成員，其表達具有組織特異性，在維持細胞極性和緊密連接屏障功能方面起著重要作用。一些研究表明，Claudin蛋白表達異常與一些惡性腫瘤的發生和發展及預后密切相關。Claudin1蛋白是1998年Furuse等[1]從雞肝中得到了一種緊密連接的蛋白質片段，其相對分子質量為22Kd。目前已有少數研究表明，Claudin-1變異的蛋白參與了腫瘤的發病過程，其中也包括大腸癌。但這種研究基本都是基于免疫組化的方法來驗證的，很少在mRNA水平上來證實。因此本研究主要利用實時熒光定量PCR的方法來探討Claudin-1基因變異的mRNA表達在大腸癌發病過程中的意義，并報道如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑逆轉錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒購自北京天根公司。Trizol從日本 Takara公司購買。

1.1.2組織標本62例大腸癌組織及對應的正常組織來自于本院2006年12月～2009年5月收集的液氮保存標本。該組病人年齡在27～82歲，其中男39例，女23例;DukesⅢ、Ⅳ期患者40例，Ⅰ、Ⅱ期患者22例。

1.1.3引物設計利用在線Primer-blast工具設計Claudin-1熒光定量PCR引物，Sensen:5'-GGGAGTGATAGCAATCTTTG，Antisensen:5'-GACAGGAACAGCAAAGTAGG-3'，全長290bp。內參照引物為Beta Actin，Sensen:5'-CACCCAGCACA ATGAAGAT -3'，Antisensen:5'-CAAATAAAGCCATGCCAAT-3'，全長255bp。引物在上海英駿公司合成。

1.2方法

1.2.1RNA提取及逆轉錄62例大腸癌組織及對應的正常組織常規Trizol提取總RNA。總RNA隨即被oligo(dT)15逆轉錄成cDNA，反應條件如下:總RNA1μg與2μLdNTPmix(10mM)和2μL oligo(dT)15(0.5μg/μL)及無RNA酶的去離子水共13.5μL混勻，離心。70℃變性5min，室溫靜置2min。然后依次添加5×Buffer4μL，0.1M DTT 1μL，Rnase inhibitor(40U/μL)0.5μL，逆轉錄酶(200U/μL)1μL，混勻，離心，放入42℃水浴中反應1h，95℃滅活5min，-20℃冷凍備用。

1.2.2Claudin-1表達檢測實時熒光定量PCR在大腸癌組織及正常大腸組織擴增Claudin-1基因，反應體系為SYBR Premix Ex(2×)10μL、上下游引物(10μmol)各0.4μL、ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4μL、cDNA 模板1μL和滅菌去離子水7.8μL，共20μL。反應條件如下:94℃變性2min，94℃變性10s，55℃退火10s，72℃延伸15s，45個循環;最后產物在72℃延伸5min，溶解曲線分析。實驗重復3次。

1.3統計學處理

采用SPSS11.5統計分析軟件包進行數據處理。本研究中我們基于目的基因和看家基因實時熒光定量擴增曲線得到Ct(C為Cycle，t為threshold)值，通過ΔCT=Ct目的基因-Ct內參基因公式，計算出目的基因相對于看家基因的表達強度。ΔΔCt=ΔCt(腫瘤樣品)-ΔCt(正常樣品)。目的基因相對腫瘤為2-ΔΔCt，當>1時，目的基因表達上調，反則下調。配對t檢驗分析大腸癌組織與正常大腸組織之間Claudin-1差異表達。Wilcoxon W統計分析大腸癌組織之間Claudin-1差異表達。

2結果

2.1RNA

大腸癌組織及對應的正常大腸組織的總RNA行1%的瓊脂糖電泳，結果如圖1。

凝膠電泳結果顯示，所有的組織都有明顯的28S和18S帶，而260/280的比值基本上都在1.75～2.13，這表明提取的總RNA質量基本合格，可以用于下一步實驗。

2.2Claudin-1在大腸癌中高表達

實時熒光定量PCR檢測了Claudin-1在大腸癌組織和相對應的癌旁大腸組織中的表達，配對t檢驗結果顯示，與正常大腸組織相比，Claudin-1在大腸癌組織中明顯高表達(P=0.000)，差異表達倍數為8倍。見表1，圖2。

2.3Claudin-1在晚期大腸癌中相對高表達

我們分析比較了Claudin-1在DukesⅢ和Ⅳ期大腸癌患者與Ⅰ和Ⅱ期患者之間表達差異，結果發現，與Ⅰ和Ⅱ期大腸癌標本相比，Ⅲ和Ⅳ期大腸癌患者Claudin-1基因明顯表達增高，兩獨立樣品Wilcoxon W統計分析，P=0.008，差異倍數為5.82倍。見表2。

3討論

直腸癌、結腸癌統稱為大腸癌，是最常見的惡性腫瘤。在消化道腫瘤中大腸癌的發病僅次于胃癌和食管癌位居第三，發病年齡多在40歲以上，男性多于女性。

大腸癌的發病與其基因調節紊亂密切相關。Claudin-1基因定位于人染色體3q28～q29，編碼211個氨基酸，其主要功能是參與了細胞間的緊密連接過程。最近的研究表明，該基因參與了多個腫瘤的發生過程。Kramer等[2]和Tokes 等[3]分別證明了乳腺癌細胞和組織中Claudin-1在mRNA和蛋白水平上的表達明顯低于周圍正常組織。然而在Miwa等研究中卻出現了相反的結果，該基因在日本人的大腸癌中卻出現了表達上調[4]。此后類似相同的報道也不斷的出現，支持Claudin-1上調可能促進了大腸癌的發病過程[5，6]，此外Claudin-1變異的高表達還出現滑膜肉瘤[7]、頸部腫瘤[8]、胃腺癌[9]和卵巢癌等[10]。

Dhawan[11]等在研究結直腸癌組織中Claudin-1促進其發病機制時發現，Claudin-1過表達可以抑制E-cadherin表達，從而促使β-cadherin/Tcf信號通路表達上調，因此可以導致腫瘤的發生發展。本次研究中利用實時熒光定量PCR檢測62例大腸癌組織及相應的正常大腸組織中Claudin-1基因mRNA的表達，配對t檢驗結果顯示，與癌旁大腸組織相比，Claudin-1在大腸癌組織中明顯高表達(P=0.000)，這表明該基因在大腸癌發病過程可能起著正向促進作用。隨后進一步分析了Claudin-1在DukesⅢ和Ⅳ期大腸癌患者與Ⅰ和Ⅱ期患者之間的表達差異，與Ⅰ和Ⅱ期的大腸癌標本相比，在Ⅲ和Ⅳ期的大腸癌中，Claudin-1基因表達明顯增高，兩獨立樣品Wilcoxon W統計分析，P=0.008，差異倍數為5.82倍。該結果提示了Claudin-1基因不但可能參與了大腸癌發病的起始過程，而且可能也促進了大腸癌的進展，以上結果初步表明了Claudin-1或許是大腸癌發病過程中的一個惡性標志物。

[參考文獻]

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(收稿日期:2010-02-09)