牡丹花瓣脂氧合酶測定方法的研究

摘 要：采用紫外分光光度法，以亞油酸鈉為反應底物，研究了牡丹花瓣脂氧合酶(LOX)的酶學特性并建立了其測定體系。結果表明，牡丹花瓣脂氧合酶反應的最適pH值為4.5，最適溫度為45℃，最適底物濃度為0.594mmol／L。該酶有著較好的熱穩(wěn)定性，90℃保溫1h后仍保持較高活性。

關鍵詞：牡丹花瓣；脂氧合酶(LOX)；測定方法

中圖分類號：Q556 文獻標識號：A 文章編號：1001—4942(2010)09—0091—04

牡丹是原產我國的世界名花，具有很高的觀賞性和藥用價值。牡丹花朵較大，開花期間香氣濃郁，目前已分離到的與牡丹花瓣芳香氣味有關的化合物主要是一些醇、醛、酯類物質。在植物體內，這些小分子物質主要是由脂氧合酶／脂氫過氧化物裂解酶(LOX／HPL)聯合催化途徑催化產生，其中LOX是該途徑的首個酶，也是一個關鍵酶。

脂氧合酶(Lipoxygenase，LOX)，又叫亞油酸氧化還原酶、脂肪氧合酶、脂肪加氧酶或類胡蘿卜素氧化酶，廣泛存在于哺乳動物、植物和微生物中。LOx是一種含非血紅素鐵或錳的加氧酶，能專一催化包括亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸在內的具有順，順－1，4－戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸及其相應酯的加氧反應，從而生成具有共軛雙鍵的脂肪酸氫過氧化物(Hydroperoxides，HPOD)。在花瓣中，HPOD再進一步被脂氫過氧化物裂解酶(Hydropemxide Lyase，HPL)及其下游一系列的酶催化，從而生成各種揮發(fā)性的小分子醇、醛和酯類物質。

目前，測定LOX活性的方法很多。常規(guī)的實驗室測定方法有分光光度法、氧電極法、同位素標記法等；快速測定方法有亞甲藍染色法(MBB)、胡蘿卜索染色法(CB)、淀粉一碘化鉀法(KI－S)等。其中，分光光度法具有快速、簡便和易于連續(xù)測定的優(yōu)點，有利于花瓣LOX酶學性質的研究以及簡便、準確、重復性好的LOX活性測定體系的建立，可為牡丹芳香氣味形成的生理基礎研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為盛花期的牡丹(洛陽紅)，試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 反應底物(亞油酸鈉母液)的制備參照Surrey等的方法，略作修改。取50μl亞油酸加入到溶有0.1gTween 20的8ml重蒸水中，然后用1mol／L氫氧化鈉溶液滴至澄清，定容至20ml，于冰箱中冷藏備用。

1.2.2 粗酶液的提取取2.0g花瓣于冷研缽中，加入預冷的0.2mol／L磷酸緩沖液(pH7.0)和0.1g的PVP，加入石英砂后研磨，組織勻漿在冷凍離心機(4℃)中15000×g離心30min，收集上清液，30℃冰箱保存，用于相關指標測定。

1.2.3 LOX活性的測定 參照Axelrod等(1981)的方法，反應溫度為室溫，反應體系為3ml(含有緩沖液2.930ml，酶液25μl，底物45μl)，加入酶液15s后開始計時，記錄3min內OD₂₃₄值的變化，酶活性以AOD₂₃₄／(gfw·min)表示。重復3次。

1.2.4 牡丹花瓣LOX最適pH值的測定設定不同pH條件：pH 3.0-6.0為磷酸二氫鈉一檸檬酸緩沖液，pH6.5—7.5為磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液，pH8.0—9.0為硼酸一硼砂緩沖液，緩沖液的濃度均為0.2mol／L，在室溫(25℃)下測定LOX活性，測定體系同1.2.3。

1.2.5 牡丹花瓣LOX最適反應溫度的測定將試管置于一定溫度(0、5、10、15、20、25、30、35、4D、45、50℃)的水浴中，依次加入粗酶液25μl、PBS緩沖液(pH4.5，0.2mol／L)2.935 ml，預熱3min后加入亞油酸鈉母液45μl。加入底物15s后立刻準確計時，記錄OD₂₃₄值，然后水浴10min，記錄10min內的OD值，酶活性以AOD₂₃₄／(gFW·min)表示。重復3次。以LOX活性最大時的溫度作為牡丹花瓣LOX的最適反應溫度。

1.2.6 牡丹花瓣LOX最適底物濃度的測定在室溫(25℃)、pH 4.5的條件下，于不同底物濃度下反應，測定LOX酶活性。測定體系同1.2.3，在3ml反應體系中分別加入底物亞油酸鈉母液5、15、25、35、45、55、65、75μl，通過調節(jié)所加緩沖液的體積來保證最終3ml體系不變。

1.2.7 牡丹花瓣LOX的熱穩(wěn)定性研究在pH4.5的條件下，采用含45μl亞油酸鈉母液的反應體系(同1.2.3)，于不同溫度(30—90℃)處理LOX粗酶液1h后，立即置于冰上，在室溫(25℃)下測定酶活。

2 結果與分析

2.1 牡丹花瓣LOX反應的最適pH值和溫度

由圖1可見，牡丹花瓣LOX在pH 4.5時有最大活性峰，在pH6.0附近還有一個較小峰。表明，牡丹花瓣組織LOX可能存在兩種同工酶形式，至于這兩個活性峰所代表的是否為不同同工酶的最適pH值，還有待進一步分離各同工酶組分后方能確定。

由圖2可見，在0—45℃范圍內，LOX活性隨溫度的升高而升高，在45℃時達到最大值，而后降低。表明，低于45℃時，增溫有利于LOX活性的提高；但超過45℃后，不利于牡丹花瓣中的LOX與底物的結合，從而導致其測定活性的降低。

2.2 牡丹花瓣LOX最適底物濃度和熱穩(wěn)定性

由圖3可見，45μl亞油酸鈉母液加入到3ml反應體系中(亞油酸的終濃度為0.594mmol／L)時所測得的LOX活性最大。在低濃度范圍內(5～45μl)，LOX活性隨底物濃度的增加而增高；但當所加底物超過45μl后，再增加底物濃度，LOX活性下降。這可能是由于反應體系中底物亞油酸濃度較高時，有一部分在空氣中自動氧化為羥基過氧化物，當羥基過氧化物達到一定濃度后，就會引起LOX的自我失活。

牡丹花瓣LOX對熱比較穩(wěn)定，隨處理溫度的升高，除50—60％之間LOX活性有小幅回落外，整體呈上升趨勢，至80℃后開始下降。且90℃處理1h，表現出的活性仍然處在較高水平(圖4)。

3 結論與討論

3.1 LOX反應最適pH值

關于植物LOX反應最適pH值的研究已有不少報道，如煙草LOX反應的最適pH值為6.5，獼猴桃的為5.0—5.5，水稻的為7.6，康乃馨的為8.6，番茄果實的為6.0。本試驗發(fā)現，牡丹花瓣LOX反應的最適pH值為4.5，且在pH6.0處也有一個較小的活性峰。類似牡丹花瓣LOX這樣有兩個反應適宜pH值的情況在其它物種中也有過報道。如來源于黃瓜果實的LOX于pH7.0處有較大活性峰，在pH9.0處有較小活性峰；來源于桃果實的LOX于pH4.5和6.0處有較高活性。

3.2 LOX反應最適底物濃度

本試驗結果表明，當3柚反應體系中所含的亞油酸母液濃度增大時，LOX活性升高，至45μl，即亞油酸終濃度為0.594 mmol／L時，所測得的LOX活性最大；之后再增加底物濃度，LOX活性反而降低。這與底物自身氧化產生的羥基過氧化物積累到一定程度后能引起LOX的失活有關。

3.3 LOX反應最適溫度及其熱穩(wěn)定性

本研究結果表明，牡丹花瓣LOX的最適反應溫度為45℃；對熱比較穩(wěn)定，90℃處理1h后其活性仍保持在較高水平。這與曾報道過的多數動物來源的LOX對熱較敏感而一些植物來源的LOX(如英國豌豆LOX、大豆LOX—1等)對熱較穩(wěn)定的論述是一致的。

本試驗采用的是紫外分光光度法測定LOX活性，其實質是測定LOX反應產物脂氫過氧化物(HPOD)的增加速率(HPOD在234nm處有吸收峰)。且本試驗所制備的LOX粗酶液中，很可能也含有處于代謝途徑中LOX下游的酶，例如脂氫過氧化物裂解酶(HPL)和丙二烯氧化物合酶(AOS)等，這些酶能夠分解消耗反應所生成的HPOD，從而導致HPOD的增加速率降低。因此推測，HPL和AOS等處于LOX反應下游的酶對熱的敏感表現與LOX并不相同，30—50℃處理，LOX和下游酶活性均升高，但LOX活性升高較快，表現為LOX活性隨處理溫度的升高而升高；50—60℃處理，其下游酶活性升高較大，表現為LOX活性降低；超過60℃后，下游酶開始失活，活性降低，而LOX活性仍比較穩(wěn)定，所以又表現為LOX活性升高；但超過80℃后，LOX也開始變性失活，活性降低。這一推測還需有關HPL和AOS等酶的熱穩(wěn)定性研究結果的驗證。

綜上所述，適合牡丹花瓣LOX的紫外分光光度測定體系：取2g花瓣于研缽內，加入8ml預冷的磷酸緩沖液(pH7.0)，冰浴研磨至勻漿，4℃、15000×g離心30min，上清即為粗酶液。3ml反應體系含亞油酸鈉母液45μl，磷酸二氫鈉一檸檬酸緩沖液(0.2mol／L，pH 4.5)2.930ml，酶液25μl，反應溫度為45℃，于234nm處測定LOX的活性。加酶15s后開始計時，記錄3min內的OD值變化，酶活以AOD₂₃₄／(gFW·min)表示。