閃式提取銀杏葉中萜類內(nèi)酯的工藝研究

[摘要] 目的 研究用閃式提取器從銀杏葉中提取銀杏萜類內(nèi)酯的工藝。方法 用正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行提取方法的研究，用高效液相色譜(HPLC)法測定銀杏內(nèi)酯的含量，流動相為甲醇-水(30:70)，流速為0.8 ml/min，用蒸發(fā)光散射檢測器，柱溫為30℃ 。結(jié)果 閃式提取銀杏葉萜類內(nèi)酯的合適工藝為:植物粒徑50目，提取時(shí)間5 min，乙醇濃度60% ，液固比20:1，此條件下萜類內(nèi)酯提取率平均值可達(dá)1.712 mg/g。結(jié)論閃式提取是一種有效的提取銀杏萜類內(nèi)酯的方法。

[關(guān)鍵詞] 閃式提取 銀杏葉 萜類內(nèi)酯

用閃式提取技術(shù)提取銀杏葉中銀杏內(nèi)酯，取影響閃式提取的主要因素即粒徑大小、提取時(shí)問、乙醇濃度和液固比4個(gè)因素，各取3個(gè)水平進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，用液相色譜法檢測銀杏內(nèi)酯提取率，并以此為評價(jià)指標(biāo)，確定最佳工藝條件。

一、器材

1. 材料與試劑。銀杏葉由浙江康恩貝制藥股份有限公司提供;銀杏萜類內(nèi)酯(白果內(nèi)酯及銀杏內(nèi)酯A、B、C)標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所;HPLC甲醇為色譜純試劑;乙醇為分析純試劑。

2. 儀器。DFY-500搖擺式粉碎機(jī)(上海鼎廣機(jī)械設(shè)備有限公司制造);DZF真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司制造);RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠制造);FSH22可調(diào)閃式提取器(鄭州金星科技有限公司制造);Waters液相色譜儀(安捷倫科技有限公司制造)。

二、 方法

1. 銀杏萜類內(nèi)酯的閃式提取。采用正交實(shí)驗(yàn)L9(34)進(jìn)行閃式提取銀杏萜類內(nèi)酯的研究，正交實(shí)驗(yàn)的因素水平表見表1。稱取粉碎后的干燥銀杏葉粉末40g倒入到閃式提取器的鐵罐中，加入適量乙醇溶液，打開閃式提取器，破碎細(xì)胞壁。實(shí)驗(yàn)完成后取出，冷卻，過濾，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至無醇味即得浸膏。

2. 色譜條件。色譜柱為Diamonsil(TM)C18(250 mm x4.6 mm，5μm);流動相為甲醇-水(30:70)，流速0.8 ml/min;蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD):漂移管溫度104 oC，載氣流速2.9 ml/min;柱溫為30℃ 。

3. 線性范圍考察。分別精密稱取對照品GA，GB，GC，BB各3，3，3，4 mg置于10 ml量瓶中甲醇加至刻度，搖勻即得混合對照品溶液，取5，2.50，0.50，0.25，0.05 ml，分別置于1O ml量瓶中加甲醇到刻度，搖勻，即得混合對照品溶液，分別吸取溶液20μl，注入HPLC儀測定。以對照品濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸。

4. 樣品溶液的制備。取實(shí)驗(yàn)得到浸膏，加10 ml水和1滴2%鹽酸，用醋酸乙酯振搖萃取4次(15，10，l0，10 m1)。合并后用5%醋酸鈉20 mI洗滌，洗滌液用10 ml醋酸乙酯萃取，合并醋酸乙酯萃取液后用水洗滌兩次，20 ml/次。合并水層，用10ml醋酸乙酯萃取，合并醋酸乙酯萃取液，回收醋酸乙酯后加l0 ml甲醇，用于進(jìn)樣。

5. 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。精密稱取同批銀杏葉粉末40g，共5份，按“樣品溶液的制備”項(xiàng)下方法操作，制備樣品溶液6份，進(jìn)行含量測定，計(jì)算RSD。

6.回收率實(shí)驗(yàn)。取已測知含量的樣品5份，分別精密加人對照品適量，依HPLC法測定，計(jì)算回收率，RSD。

三、 結(jié)果

1.HPLC結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)品線性關(guān)系

在前述色譜條件下，各種銀杏內(nèi)酯能夠很好地分離，以對照品濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸。回歸方程為:白果內(nèi)酯Y=0.563 12X-2.567 32，R=0.998;銀杏內(nèi)酯AY=0.34856X-3.15764，R=0.997;銀杏內(nèi)酯B Y=0.456 78X-4.456 24，R=0.997;銀杏內(nèi)酯C Y=0.323 55X-3.234 13，R=0.999。

2. 閃式提取銀杏萜內(nèi)酯正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，各因素對提取效果的影響程度依次為:A(顆粒大小)>B(提取時(shí)間)>C(乙醇濃度)>D(液固比)。A因素影響差異有高度顯著性，B和C因素影響差異有顯著性。比較k值，得較好的因素水平組合為A2B1C3D2 ，與單因素實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)因子組合一致。即顆粒大小為5O目，提取時(shí)間為5 min，乙醇濃度為60% ，液固比為20:1。

3. 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果。取最小濃度對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄色譜峰面積，計(jì)算得的RSD為1.34% 。

4. 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。精密稱取同批銀杏葉粉末40 g，共5份，按“樣品溶液的制備”項(xiàng)下方法操作，制備樣品溶液5份，進(jìn)行含量測定，計(jì)算RSD為1.56% 。

5. 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。取一個(gè)樣品，每隔2h進(jìn)樣1次，共進(jìn)樣5次，記錄色譜峰面積，計(jì)算所得RSD為0.34% 。

6. 回收率實(shí)驗(yàn)。取已測知含量的樣品5份，分別精密加入對照品適量，依HPLC法測定。銀杏萜內(nèi)酯平均回收率為98.75% ，RSD為0.83% 。本研究的HPLC測定法的回收率較好，方法是可行的。

7. 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。根據(jù)優(yōu)化的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顆粒大小為50目，提取時(shí)問為5min，乙醇濃度為60% ，液固比為20:1，進(jìn)行3批銀杏葉的萜類內(nèi)酯提取率分別是1.700，1.716，1.720 mg/g。平均提取率為1.712 mg/g，說明正交設(shè)計(jì)篩選的工藝是合理的。

四、 討論

閃式提取銀杏葉萜類內(nèi)酯實(shí)驗(yàn)中，各因素對萜類內(nèi)酯提取率的影響程度依次為:A(顆粒大小)>B(提取時(shí)間)>C(乙醇濃度)>D(液固比)，并由此得到合適的提取工藝條件:植物粒徑50目，提取時(shí)間5 min，乙醇濃度60% ，液固比20:1，此條件下萜類內(nèi)酯提取率平均值可達(dá)1.712 mg/g。本文首次報(bào)道了用閃式提取銀杏中的萜類內(nèi)酯的研究，利用高速機(jī)械剪切力和攪拌力，迅速破壞植物細(xì)胞組織，使組織細(xì)胞內(nèi)部的萜類內(nèi)酯與溶劑充分接觸，使有效成分快速溶解。該提取適用于工業(yè)化生產(chǎn)的放大工藝正在進(jìn)一步研究中。

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