響應(yīng)面法提取灰樹(shù)花多糖研究

孫金旭 朱會(huì)霞 高小寬 李書(shū)珍

陳 堯 林高強(qiáng) 周成銘

（衡水學(xué)院，河北 衡水 053000）

響應(yīng)面法提取灰樹(shù)花多糖研究

孫金旭 朱會(huì)霞 高小寬 李書(shū)珍

陳 堯 林高強(qiáng) 周成銘

（衡水學(xué)院，河北 衡水 053000）

利用試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design－Expert，通過(guò)二次回歸設(shè)計(jì)得到灰樹(shù)花多糖提取量與提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度關(guān)系的回歸模型，該模型能夠較好地預(yù)測(cè)灰樹(shù)花多糖提取量。在對(duì)影響多糖提取量的關(guān)鍵因素及其相互作用進(jìn)行探討后，得到的優(yōu)化提取工藝參數(shù)為：提取溫度11℃、提取時(shí)間10.35h、乙醇濃度96%，此條件下，多糖的提取量為1.72g/L。

灰樹(shù)花；響應(yīng)面；提取；多糖

灰樹(shù)花多糖是灰樹(shù)花中的重要活性物質(zhì)之一。藥理研究［1］證明，灰樹(shù)花多糖有明顯的抗腫瘤、抗肝炎、降低血壓，免疫調(diào)節(jié)之功效。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種灰樹(shù)花多糖保健品［2］。采用生物技術(shù)方法利用液體發(fā)酵培養(yǎng)灰樹(shù)花真菌菌絲體，并利用發(fā)酵液提取灰樹(shù)花多糖是目前最經(jīng)濟(jì)，最符合環(huán)保的方法［3］。但發(fā)酵培養(yǎng)后，由于發(fā)酵液成分復(fù)雜，灰樹(shù)花多糖的分離提取存在很大困難。目前，對(duì)灰樹(shù)花多糖的提取主要使用醇沉法，對(duì)醇沉條件的優(yōu)化僅限于使用正交法，而對(duì)灰樹(shù)花多糖醇沉法進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化的未見(jiàn)報(bào)道，正交法得到的工藝條件并非真實(shí)意義的最佳條件，只是理想條件，不能給出整個(gè)區(qū)域上的最優(yōu)值。響應(yīng)面分析法（RSM）是一種尋找多因素中最佳條件的統(tǒng)計(jì)方法，本試驗(yàn)利用醇沉法對(duì)灰樹(shù)花發(fā)酵液中的灰樹(shù)花胞外多糖進(jìn)行分離提取，并對(duì)灰樹(shù)花多糖的醇提條件進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化研究，以期提高灰樹(shù)花多糖的提取量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

灰樹(shù)花菌種：本實(shí)驗(yàn)室保藏；

離心機(jī)：DT5－3B，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；

發(fā)酵罐（7L）：TY4246，上海保興生物設(shè)備工程有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 灰樹(shù)花多糖提取工藝

灰樹(shù)花真菌7L發(fā)酵罐培養(yǎng)（培養(yǎng)溫度28℃、轉(zhuǎn)速200r/min、通氣量100L/h、培養(yǎng)時(shí)間10d）→灰樹(shù)花發(fā)酵培養(yǎng)液→離心沉淀除菌體（3 000r/min）→灰樹(shù)花發(fā)酵液→醇沉→灰樹(shù)花粗多糖

1.2.2 灰樹(shù)花多糖醇沉條件單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）醇沉溫度的影響：經(jīng)離心處理后的灰樹(shù)花菌體發(fā)酵上清液，在乙醇濃度95%，pH值7.0，時(shí)間8h的條件下，分別設(shè)定－4，4，10，20，30，40℃的醇沉溫度，進(jìn)行醇沉試驗(yàn)，測(cè)定其多糖提取量。

（2）醇沉?xí)r間的影響：經(jīng)離心處理后的灰樹(shù)花菌體發(fā)酵上清液，在乙醇濃度95%，醇沉溫度10℃，pH值7.0的條件下，分別設(shè)定2，4，6，8，10，12h的醇沉?xí)r間，進(jìn)行醇沉試驗(yàn)，測(cè)定其多糖提取量。

（3）乙醇濃度的影響：經(jīng)離心處理后的灰樹(shù)花菌體發(fā)酵上清液，在醇沉溫度10℃，醇沉?xí)r間10h，pH值7.0的條件下，分別 設(shè) 定 70%，75%，80%，85%，90%，95%，100% 的 乙醇濃度，進(jìn)行醇沉試驗(yàn)，測(cè)定其多糖提取量。

1.2.3 灰樹(shù)花多糖提取工藝的響應(yīng)面分析 采用Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案［6］，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，運(yùn)用SAS軟件的 RSREG （response surface regression）程序?qū)υ囼?yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行分析。

1.2.4 灰樹(shù)花多糖的測(cè)定 通過(guò)發(fā)酵罐液體培養(yǎng)獲得灰樹(shù)花真菌發(fā)酵液，發(fā)酵液3 000r/m離心處理得到發(fā)酵上清液，將得到的發(fā)酵上清液用乙醇進(jìn)行醇沉，采用苯酚－硫酸法測(cè)定總糖及還原糖的含量。多糖含量按式（1）計(jì)算：

2 結(jié)果與討論

2.1 灰樹(shù)花真菌多糖提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 醇沉溫度對(duì)灰樹(shù)花多糖提取量的影響 由圖1可知，隨著醇沉溫度的升高，灰樹(shù)花多糖提取量也逐漸上升。當(dāng)醇沉溫度達(dá)10℃時(shí)，多糖提取量達(dá)到最高（1.45g/L），醇沉溫度繼續(xù)升高時(shí)，多糖提取量反而有所減少。分析原因可能為低溫不利于灰樹(shù)花多糖的溶出，溫度過(guò)高，其他雜質(zhì)溶出過(guò)多，影響到灰樹(shù)花多糖溶出的緣故。故10℃為灰樹(shù)花多糖提取的最佳溫度。

圖1 醇沉溫度對(duì)灰樹(shù)花真菌多糖提取量的影響Figure 1 The extracting temperature impact for Grifola frondosa polysaccharides extracting

2.1.2 醇沉?xí)r間對(duì)灰樹(shù)花多糖提取量的影響 由圖2可知，隨著醇沉?xí)r間的延長(zhǎng)，灰樹(shù)花真菌多糖提取量也依次增加，到10h時(shí)多糖提取量達(dá)到最高（1.50g/L），高于10h提取，多糖量下降。故10h醇沉?xí)r間為灰樹(shù)花多糖提取的最佳時(shí)間。

2.1.3 乙醇濃度對(duì)灰樹(shù)花真菌多糖提取量的影響 由圖3可知，隨乙醇濃度的上升，灰樹(shù)花多糖的提取量也逐漸上升，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到95%時(shí)，灰樹(shù)花多糖的提取量最高（1.64g/L），乙醇濃度繼續(xù)升高，多糖量有所下降，故95%的乙醇濃度為灰樹(shù)花多糖提取的最佳濃度。

圖2 醇沉?xí)r間對(duì)灰樹(shù)花真菌多糖提取量的影響Figure 2 The extracting time impact for Grifola frondosa polysaccharides extracting

圖3 乙醇濃度對(duì)灰樹(shù)花真菌多糖提取量的影響Figure 3 The ethanol volume percentage impact for Grifola frondosa camphorata polysaccharides extracting

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化灰樹(shù)花多糖提取條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度3因素3水平共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)（3個(gè)中心點(diǎn)）進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面法灰樹(shù)花真菌多糖提取因素水平Table 1 The factors and levels of response surface for Grifola frondosa

運(yùn)用SAS軟件的RSREG程序?qū)?5個(gè)響應(yīng)值進(jìn)行分析。15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)可分為兩類(lèi)：一是析因點(diǎn)，自變量取值構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，共有12個(gè)析因點(diǎn)；二是零點(diǎn)，區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)3次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差，以多糖提取量（Y1）為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，確定函數(shù)表達(dá)式。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

用Design Expert軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，選擇對(duì)響應(yīng)值顯著的各項(xiàng)，可得提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度與灰樹(shù)花多糖提取量之間的多項(xiàng)回歸方程，回歸方程為：

回歸方程顯著性檢驗(yàn)、方差分析及最佳點(diǎn)值分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面數(shù)據(jù)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The data plan and result for response surface

表3 三因素三水平中心組和參數(shù)估計(jì)Table 3 The parameter estimating and central division for three facters and levels

對(duì)表3數(shù)據(jù)驚醒回歸分析，結(jié)果顯著，模型相關(guān)系數(shù)的平方即R2＝99.32%，回歸方程擬合程度良好，失擬性較小，可用該方程代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析。由P值可知，方程的X1、X2、X3、X1X1、X2X2和X3X3對(duì)Y值影響極顯著，表明該方程并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，方程二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值影響也很大，交互項(xiàng)影響不顯著，因此交互作用影響較小。失擬項(xiàng)p＝0.381 8，無(wú)顯著性影響，表明數(shù)據(jù)沒(méi)有異常點(diǎn)，不需要分析更高次數(shù)的項(xiàng)，模型適當(dāng)。

通過(guò)軟件分析，當(dāng)灰樹(shù)花多糖產(chǎn)量最高時(shí)：X1＝0.077 58；X2＝ 0.173 208；X3＝ 0.232 336，計(jì)算后最佳工藝為：提取溫度11℃、提取時(shí)間10.35h、乙醇濃度96%。此條件下，多糖理論提取量為1.70g/L。為了檢驗(yàn)所得結(jié)果的可靠性，采用優(yōu)化條件進(jìn)行提取試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得值為1.72g/L，與理論值相比，0.1%以內(nèi)的相對(duì)誤差，因此，響應(yīng)曲面法所得的優(yōu)化條件，灰樹(shù)花真菌多糖提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，對(duì)灰樹(shù)花多糖的醇沉條件進(jìn)行了三因素三水平的響應(yīng)面法設(shè)計(jì)，從而建立了響應(yīng)值和各個(gè)因素之間的數(shù)學(xué)模型，依據(jù)此數(shù)學(xué)模型可以預(yù)測(cè)理論提取量。根據(jù)回歸模型確定了灰樹(shù)花多糖醇沉的最佳工藝參數(shù)：提取溫度11℃、提取時(shí)間10.35h、乙醇濃度96%。此條件下，多糖的理論提取量為1.70g/L。采用上述優(yōu)化提取條件進(jìn)行3次提取試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得的平均值為1.72g/L，與理論預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差在0.1%以內(nèi)。因此，利用響應(yīng)面分析方法對(duì)灰樹(shù)花多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，可獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)。

1 Mayell M.Maitake extracts and their therapeutic potential［J］.Altern.Med.Rev.，2002（6）：6.

2 馬青，陳石良.灰樹(shù)花保健飲料加工工藝研的究［J］.食品與機(jī)械，2003（3）：22.

3 孫金旭，朱會(huì)霞，李書(shū)珍.灰樹(shù)花真菌發(fā)酵條件優(yōu)化研究［J］.食品與機(jī)械，2009，25（6）：131～133.

4 Ahuja S K，F(xiàn)erreira G M，Moreira A R.Application of Plackett－Burman design and response surface methodology to achieve exponential growth for aggregated shipworm bacterium［J］.Biotechnology and Bioengineering，2004（85）：666～675.

Study ongrifola frondosapolysaccharides extracting by response surface method

SUN Jin－xu ZHUH ui－xia GAO Xiao－kuan LI Shu－zhen

CHEN Yao LIN Gao－qiangZHOU Cheng－ming

（Hengshui College，Hengshui，Hebei053000，China）

The regression model，related to the amount ofgrifola frandosuspolysaccharide extraction，extracting temperature，extracting time，ethanol concentration，was obtained by using Design－Expert experimental design software through quadric regression design.The regression model would be a fairly reliable forecast for extraction ofgrifola frandosuspolysaccharide.The optimized extraction parameters were obtained as follows：extraction temperature 11℃，extraction time 10.35h，ethanol concentration 96%.Under the conditions，the extraction amount ofgrifola frandosuspolysaccharide in theoretically reached 1.70g/L.

grifola frondosa；response surface；extracting；REPS

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.05.038

衡水學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新課題（編號(hào)：2010058）

孫金旭（1975－），男，衡水學(xué)院講師，博士研究生。E－mail：bdsunjinxu＠163.com

2010－05－11