煙臺(tái)海域中度嗜鹽菌分離、鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化研究

馮二梅，宿紅艷，王磊

(魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025)

煙臺(tái)海域中度嗜鹽菌分離、鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化研究

馮二梅，宿紅艷，王磊

(魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025)

為研究山東煙臺(tái)海域中度嗜鹽菌的分布情況及種群特征，從煙臺(tái)近海鹽場(chǎng)采集的土樣和水樣中利用高氏一號(hào)培養(yǎng)基分離得到 22 株中度嗜鹽菌。通過菌落形態(tài)觀察、生理生化特征分析比較，選取其中的 9 株進(jìn)行 16S rDNA 序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明這些中度嗜鹽菌分別屬于7 個(gè)屬：芽孢桿菌屬 (Bacillus)、枝芽孢桿菌屬 (Virgibacillus) 、薄壁芽孢桿菌屬 (Gracilibacillus)、劉氏菌屬 (Liuella)、產(chǎn)微球莖菌屬 (Microbulbifer)、擬諾卡氏菌屬 (Nocardiopsis)和交替單胞菌屬 (Alteromonas)，其中菌株YTM-8 、YTM-12 和YTM-13可能是潛在的新種。以上研究結(jié)果表明煙臺(tái)海域中存在有較為豐富的嗜鹽微生物多樣性，并且潛藏著新類型的嗜鹽菌資源。

煙臺(tái)海域；嗜鹽菌；16S rDNA；生物多樣性；系統(tǒng)進(jìn)化分析

嗜鹽菌 (Halophiles) 是在海洋、鹽湖、鹽場(chǎng)以及腌制品等高鹽環(huán)境中生存的微生物。特殊的生存環(huán)境使嗜鹽菌具有極為特殊的生理結(jié)構(gòu)和代謝機(jī)制,并且還產(chǎn)生了許多具有特殊功能的天然活性物質(zhì)[1],對(duì)它的研究既具有理論意義,又有應(yīng)用價(jià)值。近年來，嗜鹽菌作為一類具有很大潛力的生物資源已被人們廣泛關(guān)注。通過嗜鹽菌的開發(fā)與多樣性的研究，從海洋中尋找微生物新種和具有特殊功能的生理活性物質(zhì)成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[2]。

根據(jù)微生物對(duì)鹽濃度的反應(yīng)可分為不同的種[3]，即非嗜鹽菌（在含0.2 mol/L鹽的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好)，多數(shù)普通真細(xì)菌和多數(shù)淡水微生物屬于這一類群；輕度嗜鹽菌（在含0.2 ～ 0.5mol/L鹽的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好），很多海洋微生物屬于這個(gè)類群；中度嗜鹽菌（在含0.5 ～ 2.5 mol/L 鹽的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好）；邊緣極端嗜鹽菌（在含1.5 ～ 4.0 mol/L 鹽的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好）；極端嗜鹽菌（在含2.5 ～ 5.2 mol/L鹽的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好）和耐鹽菌（能耐鹽的非嗜鹽菌）。其中，中度嗜鹽菌（Moderately halophilic bacteria）耐鹽范圍寬、分布廣、更易于適應(yīng)高鹽環(huán)境。中度嗜鹽菌耐鹽性很強(qiáng)，它們可在0.1% ～ 32.5%的NaCl濃度條件下生長(zhǎng)[4]。目前，中度嗜鹽菌的研究主要集中在生理生化特性、系統(tǒng)發(fā)育、嗜鹽機(jī)制等方面，已有的研究結(jié)果表明中度嗜鹽菌有著重要的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景[5-7]。

中度嗜鹽菌種類繁多，尚存在大量未分離鑒定的種質(zhì)資源，限制了其研究和開發(fā)的深入。它們的分類主要依據(jù)三個(gè)方面：表型特征、化學(xué)分類數(shù)據(jù)和分子生物學(xué)數(shù)據(jù)[5]。目前我國(guó)已陸續(xù)在新疆[8]、西藏、內(nèi)蒙古等地開展過對(duì)中度嗜鹽菌的研究和多樣性的調(diào)查。本研究從煙臺(tái)近海鹽場(chǎng)底泥中分離鑒定了一批中度嗜鹽菌，并利用16S rDNA作為分子指標(biāo)對(duì)這些菌株進(jìn)行分子分類鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化分析，以期了解煙臺(tái)海域中度嗜鹽菌的多樣性及分子系統(tǒng)進(jìn)化情況，為進(jìn)一步開發(fā)和利用打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品的采集和菌株分離

底泥樣品采集自煙臺(tái)牟平東海鹽場(chǎng)鹽池，樣品經(jīng)梯度稀釋后涂布于高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板上，于28℃培養(yǎng)2 ～ 3周后，根據(jù)菌落大小、形態(tài)、顏色進(jìn)行初步分離篩選并純化。純化后的菌種轉(zhuǎn)接至高氏一號(hào)斜面培養(yǎng)基，4℃保存。

1.2 培養(yǎng)基

高氏一號(hào)培養(yǎng)基：KNO31.0 g，F(xiàn)eSO4?7H2O 0.01 g，MgSO4?7H2O 0.5 g，K2HPO40.5 g，可溶性淀粉20 g，瓊脂20 g，NaCl視需要添加，定容至1 000 mL。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5.0 g，NaCl視需要添加，瓊脂粉15 g，定容至1 000 mL。以上不加瓊脂粉為液體發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.3 形態(tài)觀察

菌株接種于高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)72 h，觀察菌落大小、顏色、形態(tài)等特征。

1.4 生物學(xué)特性實(shí)驗(yàn)

1.4.1 耐鹽度實(shí)驗(yàn) 供試菌株單菌落過夜震蕩培養(yǎng)，按照1%接種量分別接種于不同NaCl濃度(1%, 3%,5%, 7%, 10%, 13%, 15%) 的LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)12 h，測(cè)定培養(yǎng)液的光密度值(OD578)。

1.4.2 溫度耐受性實(shí)驗(yàn) 供試菌株單菌落過夜震蕩培養(yǎng)，按照1%接種量接種于含3% NaCl的LB液體培養(yǎng)基中，分別置于20℃, 30℃, 37℃, 45℃, 55℃中150 r/min震蕩培養(yǎng)12 h，測(cè)定培養(yǎng)液的光密度值(OD578)。1.4.3 pH值對(duì)生長(zhǎng)影響的測(cè)定 供試菌株單菌落過夜震蕩培養(yǎng)，按照1%接種量接種于pH值分別為4, 5,6, 7, 8, 9的含3% NaCl的LB培養(yǎng)液中，28℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)12 h，測(cè)定培養(yǎng)液的光密度值 (OD578)。

1.5 生理生化特性

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[2,9]所列中度嗜鹽菌生理生化指標(biāo)，并參照《微生物分類學(xué)》[10]及《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第8版)[11]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[12]中有關(guān)方法進(jìn)行生理生化特征的鑒定。

1.6基于16S rDNA的系統(tǒng)進(jìn)化分析

1.6.1 基因組 DNA 的提取 采用寶生物工程(大連)有限公司的 TaKaRaMiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0試劑盒提取。

1.6.2 16S rDNA基因的 PCR擴(kuò)增和測(cè)序 以各菌株基因組 DNA為模板，采用正向引物：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’和反向引物：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系 (25 μL)：10 × Buffer 2.5 μL，25 mmol/LMgCl22.0 μL，2.5 mmol/LdNTP 2.0 μL，TaqDNA 聚合酶1U，引物各2.0 μL，模板2.0 μL，雙蒸水12 μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性10 min，94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，循環(huán)35次，72℃后延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Elutemilk小量膠回收試劑盒（上海飛捷生物技術(shù)有限公司）純化后，送上海生物工程有限公司測(cè)序。

1.6.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建和分析 根據(jù)各菌株16S rDNA的測(cè)序結(jié)果，用Blastn軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性搜索，尋找同源序列。選取分值較高的序列采用ClustalX1.8[13]進(jìn)行多序列比對(duì) (alignment)，然后運(yùn)用MEGA4.0分析軟件中的鄰近結(jié)合法 (Neighbor-Joining，NJ) 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，通過1 000次取樣計(jì)算其Bootstrap值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種分離結(jié)果

經(jīng)分離純化，去除重復(fù)菌株，共得到9株中度嗜鹽菌，通過形態(tài)觀察可初步判定其為中度嗜鹽細(xì)菌和放線菌。觀察結(jié)果顯示YTM-8和YTM-15菌落形態(tài)特征相近，菌落白色，干燥，具有放線菌屬特征，可初步判定其為同一個(gè)屬。剩余菌株的形態(tài)大體相同，菌落濕潤(rùn)、透明，具有明顯的細(xì)菌菌屬特征。

2.2 表型特征

供試的9菌株的NaCl生長(zhǎng)范圍較為廣泛，可在濃度為1% ～ 15%之間良好生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)NaCl濃度為3% ～ 7%，當(dāng)NaCl濃度達(dá)到15%，菌株生長(zhǎng)緩慢，只有個(gè)別的菌株生長(zhǎng)稍好，沒有發(fā)現(xiàn)極端嗜鹽菌的存在，均為中度嗜鹽菌。溫度耐受性實(shí)驗(yàn)顯示，這些中度嗜鹽菌溫度生長(zhǎng)范圍亦較為廣泛，可在55℃的高溫下較好生長(zhǎng)，最適溫度范圍30 ℃ ～ 45 ℃。其pH值生長(zhǎng)范圍在4.0 ～ 10之間，最適pH為6.0 ～ 8.0不等。

依據(jù)菌落形態(tài)觀察結(jié)果，YTM-8和YTM-15初步確定其屬于放線菌屬，因此，對(duì)其余7個(gè)供試菌株進(jìn)行了23項(xiàng)生理指標(biāo)的鑒定，其中反硝化和苯丙氨酸脫氨等反應(yīng)表現(xiàn)為陰性；產(chǎn)硫化氫、V.P和精氨酸脫羧實(shí)驗(yàn)中只有菌株YTM-5表現(xiàn)陽性，其余菌株均為陰性；酪氨酸水解實(shí)驗(yàn)只有YTM-13為陽性；過氧化氫酶和產(chǎn)吲哚實(shí)驗(yàn)顯示供試菌株均為陽性。而對(duì)YTM-8和YTM-15兩個(gè)菌株只選擇了14項(xiàng)放線菌屬典型生理指標(biāo)進(jìn)行了鑒定(同一表中其它生理指標(biāo)以0表示)，其中反硝化作用、淀粉水解、明膠水解、石蕊牛奶等反應(yīng)均為陰性；吲哚實(shí)驗(yàn)均為陽性反應(yīng)；氧化氫酶實(shí)驗(yàn)菌株YTM-8為陽性反應(yīng)而YTM-15為陰性反應(yīng)。另外，本研究分別以蔗糖、麥芽糖、核糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖和甘露醇作為碳源對(duì)被測(cè)菌株進(jìn)行碳源利用實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明除供試菌株YTM-6、YTW-10和YTM-13碳源利用范圍較廣以外，其余大部分中度嗜鹽菌菌株的碳源利用范圍較窄。菌株之間的生理生化特征等表型差異顯著(表1)。

2.3 數(shù)據(jù)庫序列比對(duì)分析結(jié)果

將測(cè)得的序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫，以Blastn程序進(jìn)行相似性搜索，序列同源性比對(duì)結(jié)果見表2。

同源性小于93% ～ 95%，可以認(rèn)為屬于不同屬，鑒定的9株菌中除了YTM-9外其余菌株均與數(shù)據(jù)庫中同一屬的菌株具有大于95%的同源性，由此可以確定它們的菌屬：YTM-3菌株屬于劉氏菌屬 (Liuella)，YTM-5菌株屬于芽孢桿菌屬 (Bacillus)，YTM-7和YTM-12菌株屬于產(chǎn)微球莖菌屬 (Microbulbifer)，YTM-8和YTM-15菌株屬于擬諾卡氏菌屬 (Nocardiopsis)，YTW-10菌株屬于交替單胞菌屬 (Alteromonas)，YTM-13菌株屬于薄壁芽孢桿菌屬 (Gracilibacillus)。該鑒定結(jié)果與菌落形態(tài)觀察和生理生化特征分析結(jié)果相一致。菌株YTM-9雖然也與數(shù)據(jù)庫中的菌屬存在較大的同源性，但是同源性最大的前5株菌中包含了3個(gè)不同的屬，分別為Virgibacillus，Oceanobacillus，Bacillus，且同源性都為99%。因此其菌屬的確定有賴于進(jìn)一步的系統(tǒng)進(jìn)化分析。

一般認(rèn)為，16S rDNA序列同源性小于98%，可以認(rèn)為屬于不同的種[14,15]。除了菌株YTM-9以外的其它8個(gè)菌株中，YTM-8、YTM-12和YTM-13與數(shù)據(jù)庫中的有效發(fā)表菌種之間同源性均小于98%，尤其是菌株YTM-8和YTM-12與數(shù)據(jù)庫中未確定種名的菌種之間最高同源性也僅為98%和96%的相似性，它們可能是潛在的新種。YTM-15與Nocardiopsisaegyptica，Nocardiopsistangguensis同源性都是99%，也不能確定其種名，需要通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹確定，其它菌株與已確定種名的菌種之間同源性為99%，可以確定它們的種名。

表 1 煙臺(tái)海域分離的9種中度嗜鹽菌菌株生理學(xué)特性比較Tab. 1 Physiological properties test of moderately halophilic bacteria isolated from Yantai Sea area

表 2 中度嗜鹽菌16S rDNA序列鑒定結(jié)果Tab. 2 16S rDNA sequences analysis result of moderately halophilic bacteria

圖 1 鄰接法構(gòu)建的基于16S rDNA基因序列的中度嗜鹽菌的系統(tǒng)發(fā)育樹分支處的數(shù)值為bootstrap值。Fig. 1 Neighbor-Joining tree based on16S rDNA gene sequences of moderately halophilic bacteria The numbers on internal branches are bootstrap values.

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

提取供試的9株中度嗜鹽菌的基因組DNA，擴(kuò)增16S rDNA片段，測(cè)定其16S rDNA序列并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。依據(jù)16S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性搜索，選取同源性較高的相關(guān)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，經(jīng)NJ法分析獲得的進(jìn)化樹，見圖1。

根據(jù)圖1可以看出，9個(gè)供試菌株分別屬于7個(gè)屬。其中通過同源比對(duì)無法確定屬名的YTM-9根據(jù)與其相近的三個(gè)菌屬Virgibacillus，Oceanobacillus，Bacillus的聚類關(guān)系上看，YTM-9與Virgibacilluspicturae聚在一起，可以確定其為枝芽孢桿菌屬。其它菌株的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與同源比對(duì)結(jié)果相一致，進(jìn)一步確定了它們的屬名。

3 討 論

盡管在當(dāng)今“基因組學(xué)”的時(shí)代，對(duì)嗜鹽菌的分離鑒定仍然是海洋微生物研究中非常重要的一項(xiàng)內(nèi)容。如今所鑒定得到的中度嗜鹽菌可能只是其冰山一角，隨著分子技術(shù)水平的提高，利用分子手段去闡明中度嗜鹽菌在環(huán)境中的生物多樣性及明確它們的分類是今后一項(xiàng)長(zhǎng)期的工作。所以，還需要更深入的積累和研究更多的中度嗜鹽菌資源[16]。

為了解煙臺(tái)海域中度嗜鹽菌菌種資源特征，分離并獲得這些嗜鹽菌菌種資源，本研究通過對(duì)采集樣品分離和純化，共獲得了22株嗜鹽菌。選取其中9株菌株進(jìn)行了個(gè)體形態(tài)觀察及生理生化特性測(cè)定，通過對(duì)16S rDNA分子序列測(cè)定分析并構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，從而對(duì)它們進(jìn)行了種屬鑒定。

無論是從形態(tài)上還是從生理特性上，YTM-8菌株和 YTM-15菌株都比較接近，系統(tǒng)進(jìn)化樹也顯示YTM-8和YTM-15均屬于擬諾卡氏菌屬 (Nocardiopsis)，但該屬在進(jìn)化樹中分成兩簇，YTM-8和YTM-15分別聚在不同的簇中。YTM-7和 YTM-12雖同屬于產(chǎn)微球莖菌屬 (Microbulbifer)，但 YTM-7與有效種Microbulbiferhalotolerans聚在一起，YTM-12則聚在另一相對(duì)獨(dú)立的分支上，并形成了一個(gè)獨(dú)立的亞分支，提示該菌株可能是一個(gè)潛在的新種。綜合16S rDNA序列和系統(tǒng)進(jìn)化分析，YTM-3,YTM-7和YTM-9可以初步確定種名為L(zhǎng)iuellaqinghaiensis,Microbulbiferhalotolerans與Virgibacilluspicturae。由進(jìn)化樹可以看出YTM-5, YTM-8, YTW-10, YTM-13和YTM-15均與相應(yīng)菌屬的未定名種聚在一起，YTM-12則形成一個(gè)單獨(dú)的進(jìn)化支，結(jié)合數(shù)據(jù)庫序列比對(duì)分析結(jié)果，菌株YTM-8, YTM-12和YTM-13與有效菌種的同源性小于98%，因此，YTM-8, YTM-12與YTM-13可能是潛在新種。

通過對(duì)煙臺(tái)海域嗜鹽菌鑒定和分析的初步研究充分證明了煙臺(tái)海域中度嗜鹽菌種群的多樣性和豐富性，并可能潛藏著新類型的嗜鹽菌資源。在本實(shí)驗(yàn)分離鑒定的7個(gè)菌屬中，芽孢桿菌、交替單胞菌屬、產(chǎn)微球莖菌和擬諾卡氏放線菌都能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、作用特殊的生物活性物質(zhì)，具有較強(qiáng)的抗菌、抗病毒、抗原蟲、產(chǎn)酶、抗腫瘤及產(chǎn)其它活性物質(zhì)等活性，為新藥的開發(fā)奠定基礎(chǔ)[17-20]。本實(shí)驗(yàn)分離鑒定的中度嗜鹽菌對(duì)今后進(jìn)一步研究這些微生物資源具有重要意義，同時(shí)也為渤海海洋資源的深入認(rèn)識(shí)和進(jìn)一步開發(fā)利用提供了菌種資源。

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Isolation, identification and phylogenetic analysis of moderately halophilic bacterium isolated from Yantai Sea area

FENG Er-mei , SU Hong-yan , WANG Lei

( College of Life Sciences, Ludong University, Yantai 264025，China )

To study the distribution and characteristics of moderately halophilic bacteria, the samples were collected from salt field near Yantai sea area in Shandong province. 22 ocean moderately halophilic bacteria strains were isolated on Gause I agar medium. Based on the morphological, physiological and biochemical analysis, the 9 strains were chosen for 16 S rDNA amplification and phylogenetic analysis. Phylogenetic analysis based on 16 S rDNA gene sequences indicated that these moderately halophilic bacteria strains belonged to 7 genera includingLiuella,Bacillus,Virgibacillus,Gracilibacillus,Microbulbifer,Nocardiopsis, andAlteromonasrespectively. The Strains of YTM-8,YTM-12 and YTM-13 may represent potential new species of their genus. The research results indicate that Yantai sea area is rich in halophilic bacterium diversity and contains new types of microorganism resources.

Yantai sea area; halophilic bacterium; 16 S rDNA; biodiversity; phylogenetic analysis

Q939

A

1001-6932(2010)01-0052-07

2009-03-12；

2009-07-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目( 30740017 ); 魯東大學(xué)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目

馮二梅(1981－)，女，山東菏澤人，碩士研究生，研究方向?yàn)楹Ｑ笊锛夹g(shù)。電子郵箱：fengermei521@163.com

宿紅艷(1976－)，女，山東淄博人，副教授，博士，主要從事分子細(xì)胞生物學(xué)研究。電子郵箱：suhongyan66@126.com