不同N水平下緣管滸苔對重金屬銅的響應

徐軍田，鄒定輝，朱明，郭贛林，李信書，劉樹霞

（1. 淮海工學院海洋學院 江蘇 連云港 222005；

2. 華南理工大學環境科學與工程學院 工業聚集區污染控制與生態修復教育部重點實驗室 廣東 廣州 510006）

不同N水平下緣管滸苔對重金屬銅的響應

徐軍田1，鄒定輝2，朱明1，郭贛林1，李信書1，劉樹霞1

（1. 淮海工學院海洋學院 江蘇 連云港 222005；

2. 華南理工大學環境科學與工程學院 工業聚集區污染控制與生態修復教育部重點實驗室 廣東 廣州 510006）

探討了重金屬銅對兩種N水平生長條件下緣管滸苔生長、光合作用、硝酸還原酶活性以及色素和蛋白含量的影響。結果表明，兩種N水平下，銅離子都顯著抑制藻體的生長速率，并且隨著濃度的增加而增大；而N加富顯著促進藻體的生長速率，但這種作用在高濃度銅（2 μM）的作用下不顯著。高濃度的銅和N同時存在時，藻體的光合作用速率顯著下降，硝酸還原酶活性也顯著降低。高濃度的銅顯著降低類胡蘿卜素和可溶性蛋白的含量，在N加富的情況下，這種抑制作用更為顯著。

緣管滸苔；銅；N； 光合作用；相對生長速率

海水的富營養化是近年來引起廣泛關注的重要海洋環境問題，海域的富營養化日益加劇，影響了大型海藻棲息的海洋生態環境條件。大型海藻是近岸海域重要的初級生產者，它貢獻了海洋 10 %的初級生產力，對近岸海域海域碳循環起著很重要的作用。氮往往是海藻生長過程中的限制性元素，但是在富營養化過程中，海水中氮水平急劇增加。研究富營養化與大型海藻的關系具有重要的生態意義，一方面，目前許多學者認為大型海藻的廣泛養殖是吸收和利用營養物質，延緩并改善水域富營養化的有效措施之一[1,2]；另一方面，近岸海域的富營養化不但與赤潮的發生等海洋生態災害有直接的關系，而且，這也可能與某些機會主義生態類型的大型海藻種類如滸苔等的爆發性生長（如“綠潮”、“藻華”現象）有關。

重金屬污染是另一個重要的海洋環境問題，其中銅是主要的污染物之一，關于銅對海洋大型藻類的效應已在國內外得到了很好的研究[3-6]。雖然在真核生物的基本生命過程中，銅是不可缺少的一種微量元素，但是高濃度的銅卻成為海洋生物中最具有毒性的重金屬之一，它對生物代謝的大多數過程都有一定的影響[7]。海洋污染的日趨加重，各種污染物并不是單一的出現在某個海域，如工業廢水中不僅僅含有大量的氨氮，同時還有大量的重金屬，這樣海區內就成為多種污染物的混合體，研究近岸海域大型海藻對這些污染的響應，不僅僅要考慮每種污染物對藻體的效應，更要研究它們共同作用藻體的互作效應。

本文以常見大型綠藻緣管滸苔為材料，從生長速率、光合生理、硝酸還原酶活性以及色素和蛋白含量方面來研究氮和銅對藻體的結合效應，為綜合評價海洋環境污染對近岸大型藻類的影響提供一定的實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

緣管滸苔（Enteromorpha linza）于 2010年 3月采自連云港高公島。材料用過濾海水清洗干凈后，選取色澤鮮綠，寬度適中的健康藻體于玻璃水族箱內暫養，暫養的條件是溫度為 12 ℃，光強為200 μmol m-2s-1，光周期為 12 h︰12 h；培養液為過濾的自然海水，每兩天更換一次，每天24 h通氣培養。

1.2 培養

選取滸苔寬度為1 cm左右的藻體，用剪刀切為長度大約3 cm的小段，放入1 L的三角燒瓶內充氣培養，培養的溫度、光強和光周期均與暫養條件相同。實驗設置2個N 營養鹽水平和3個銅離子濃度共6個處理組合：兩種N水平是對照N水平的海水（N0，其N的含量約為36 μM）、以及N加富處理的海水（通過在過濾的自然海中加入300 μmol/L的NaNO3, N300）；對每種N水平處理下設置3個重金屬（Cu）梯度，即海水中銅的總濃度分別為對照水平（Cu0，Cu濃度約為0.06 μM），0.5 μM和2 μM （通過分別向海水中添加0.5 μM和2 μM CuSO4.5H2O獲得）。每個處理3次重復。培養液每兩天更換一次，且24 h通氣培養。

1.3 生長測定

每隔一天測定一次藻體的鮮重，藻體的相對生長速率（Relative growth rate , RGR）按照以下公式求得：RGR=100*(lnNt- lnN0)/t，其中Nt為第t天藻體的重量，N0為藻體的初始重量。

1.4 光合作用的測定

用氧電極法 (Hansatech，英國) 測定緣管滸苔光合放氧速率。測定之前，把藻體用鋒利的小剪刀剪成約 0.2 cm2大小的小片，在室內低光下適應 1 ～2 h，最大程度的消除藻體損傷帶來的測定誤差。 然后稱取大約 20 mg 鮮重 (FW) 的藻片(大約20片)放入裝有2 mL 反應介質的反應槽中。用循環水浴精確控制反應槽內的溫度為12 ℃。光強梯度是通過調節光源與反應槽的距離獲得。光強響應曲線參數通過以下公式[8]獲得：P = Pmax*tanh(α*I/Pmax) +Rd，其中P為光合作用速率，Pmax為最大光合作用速率，α為光合效率，I為光強強度，Rd為呼吸作用速率。

1.5 色素的測定

對不同培養條件下的藻體，測定其葉綠素 a（Chla）、葉綠素b（Chlb）和類胡蘿卜素（Car.）的含量。取大約0.1 g藻體置于10 mL的甲醇中，放置于4 ℃的冰箱內過夜處理，然后用分光光度計測定提取液在470，653和666 nm的吸光值。色素含量按照以下公式計算[9]：葉綠素-a=15.65A666-7.34A653；葉綠素b = 27.05A653-11.21A666；類胡蘿卜素 =（1 000A470+ 1 403.57A666-3 473.87A653）/221。 其中A470、A653、A666分別表示在470 nm，653 nm和666 nm的光密度值。

1.6 蛋白含量的測定

取藻體0.2 g，加10 ml pH 7.5的磷酸緩沖液和少量石英砂于研缽內研磨，然后以10000 g 4 ℃冷凍離心10 min，取上清液，采用考馬斯亮蘭G—250( Coomassie Brilliant Blue G-250 ) 染料結合法[10]測定可溶性蛋白的含量。

1.7 硝酸還原酶的測定

通過測定一定量藻體 ( 活體 ) 在一定量反應介質中單位時間內產生的亞硝氮 ( NO2-) 的量來表示藻體的硝酸還原酶活性（NRA）[11]。稱取0.2 g藻體加入10 mL反應介質緩沖液 ( 0.1 M pH7.5的磷酸緩沖液，0.01 mM 的葡萄糖；0.5 mM 的Na-EDTA；200 mM的NaNO3)，充氮氣2 min，后在黑暗條件下30 ℃反應30 min。取反應介質1 mL，加入2 mL磺胺和2 mL的鹽酸萘乙二氨試劑，混勻，靜置30 min，用分光光度計測定520 nm處的吸光值，根據標準曲線的回歸方程計算亞硝氮的含量，用單位時間和單位質量藻體產生亞硝氮的量來表示硝酸還原酶活性（μmolNO2-g-1h-1）。

1.8 數據處理

實驗數據采用方差分析法（one- or two-way ANOVA） 或T-test分析，設置顯著水平為P＜ 0.05。

2 結 果

銅對緣管滸苔的生長有著顯著的影響（P＜0.05），兩種 N水平下培養的藻體生長增長量都隨著銅的增加而降低（圖1A）, 銅顯著降低藻體的相對生長速率（RGR），2 μΜ銅的抑制作用最大，與對照相比，N加富培養下的RGR下降約72%，正常N水平下的下降為67%（圖1B）。N加富顯著促進藻體的RGR（P＜ 0.05），但這種作用在高濃度銅( 2 μΜ ) 的作用下不顯著（P＞ 0.05）。

圖 1 在不同Cu處理（0，0.5和2 μM）以及兩種N水平（0和300 μM）培養下緣管滸苔鮮重（A）和RGR（B）的變化（圖中N0、N300分別表示培養海水中的兩種N水平：0和300 μM；Cu0，Cu0.5，Cu2分別表示培養海水中的3種Cu離子水平：0，0.5和2 μM。）Fig. 1 Changes of fresh weight (A) and RGR (B) of Enteromorpha linza cultured at two different N availabilities（0 and 300 μM）and different Cu exposures (0, 0.5 and 2 μM). Means±SD (n=3).

緣管滸苔藻體的光合作用在不同的處理下呈現不同的變化趨勢（圖 2）。銅顯著降低兩種N水平培養下藻體的光合效率（α）（P＜ 0.05），并且隨著濃度的增加抑制作用增大（表1）。 N加富顯著提高了藻體在銅濃度為 0和 0.5μΜ 時的光合效率（P＜ 0.05），但在2μΜ銅處理下的藻體，N加富卻呈現相反的效應。對于藻體的最大光合作用速率來說，N加富培養下的藻體，銅濃度只有在2 μΜ時才有顯著的抑制作用（P＜ 0.05）。在正常N水平下培養的藻體，最大光合作用速率隨著銅濃度的增加而顯著降低（P＜ 0.05）。 N加富對銅濃度為0培養的藻體最大光合作用速率沒有顯著影響，但卻顯著促進了0.5μΜ銅濃度培養下藻體的最大光合作用速率（P＜ 0.05），而對于培養在2 μΜ銅濃度下的藻體來說，N加富卻體現為抑制作用。正常N水平下培養的藻體在銅濃度為2μΜ時其光飽和光強（Ik）顯著低于銅濃度為0時的藻體，除此之外，所有處理間沒有顯著差異（P＞ 0.05）（表1）。

在N加富的情況下，銅顯著降低硝酸還原酶的活性（P＜ 0.05），并且隨著濃度的增加抑制作用增大；而在正常N水平下，0.5 μΜ銅顯著促進硝酸還原酶的活性，而2 μΜ銅顯著抑制硝酸還原酶的活性（P＜ 0.05）。N加富顯著促進藻體在銅濃度為0和0.5 μΜ時的硝酸還原酶活性（P＜ 0.05），但在2 μΜ銅作用下卻表現為抑制效應 (圖 3)。

圖 2 在不同Cu處理（0，0.5和2 μM）以及兩種N水平（0和300 μM）培養下緣管滸苔光合作用-光強響應曲線（P-I 曲線）（圖中N0、N300分別表示培養海水中的兩種N水平：0和300 μM；Cu0，Cu0.5，Cu2分別表示培養海水中的3種Cu離子水平：0，0.5和2 μM。）Fig. 2. P-I curves of Enteromorpha linza cultured at two different N availabilities （0 and 300 μM）and different Cu exposures (0, 0.5 and 2 μM).Means±SD (n=3).

在正常N水平下，銅對葉綠素a（Chla）含量沒有顯著的影響，但在N加富的情況下，銅顯著提高Chla的含量（P＜ 0.05），但兩個銅加富處理之間沒有顯著差異（P＞ 0.05）。而N加富卻顯著提高所有銅濃度水平下的Chla的含量（P＜ 0.05）（圖4A）。Chlb呈現和Chla相同的變化趨勢（圖 4B）。在正常N水平下，類胡蘿卜素（Car.）的含量變化趨勢和Chla和Chlb一致，但在N加富的情況下，0.5 μΜ銅處理下的藻體的Car.含量最高，而2 μΜ銅處理下的最低，三者處理之間都有顯著性差異（P＜ 0.05）。N加富顯著提高藻體在銅濃度為0和0.5 μΜ時的Car.含量, 但在2 μΜ銅作用下卻表現為相反的效應（圖 4C）（P＜ 0.05）。

圖 3 在不同Cu處理（0，0.5和2 μM）以及兩種N水平（0和300 μM）培養下緣管滸苔硝酸還原酶活性(NRA)的變化（圖中N0、N300分別表示培養海水中的兩種N水平：0和300 μM。）Fig. 3 Changes of NRA activity of Enteromorpha linza cultured at two different N availabilities（0 and 300 μM）and different Cu exposure (0, 0.5 and 2 μM). Means±SD (n=3).

表 1 在不同Cu處理（0，0.5和2μM）以及兩種N水平（0和300μM）培養下緣管滸苔光合作用-光強響應曲線參數（N0、N300分別表示培養海水中的兩種N水平：0和300μM；Cu0，Cu0.5，Cu2分別表示培養海水中的3種Cu離子水平：0，0.5和2μM）Tab. 1 Photosynthetic parameters of P-I curves for Enteromorpha linza cultured at two different N availabilities （0 and 300 μM）and different Cu exposures (0, 0.5 and 2 μM). Pmax, the maximum net photosynthetic rate[μmolO2·g(f.wt)-1·h-1]; α, the photosynthetic efficiency[(μmolO2·g(f.wt)-1·h-1) / (μmol·m-2·s-1)]; Ik, light saturation point(μmol·m-2·s-1). Means±SD (n=3).

在N加富的情況下，銅顯著降低可溶性蛋白的含量，在2 μΜ銅處理下的含量最低。而在正常N水平下，只有高濃度的銅 ( 2 μΜ ) 顯著降低可溶性蛋白的含量。N加富顯著提高藻體在銅濃度為0和0.5 μΜ時的可溶性蛋白含量, 但在2 μΜ銅作用下卻表現為相反的效應 ( 圖 5 )。

圖 4 在不同Cu處理（0，0.5和2 μM）以及兩種N水平（0和300 μM）培養下緣管滸苔Chl a（A）, Chl b (B)和類胡蘿卜素（Car.）(C)的變化（圖中N0、N300分別表示培養海水中的兩種N水平：0和300 μM。）Fig. 4 Changes of contents of Chl a (A), Chl b (B) and Car. (C) in Enteromorpha linza cultured at two different N availabilities（0 and 300 μM）and different Cu exposures (0, 0.5 and 2 μM). Means±SD (n=3).

3 討 論

銅顯著降低了緣管滸苔的生長速率，并且隨著濃度的增加抑制作用增大，這種效應在其它一些大型海藻種類中也得到了證實[7]。海水中的營養鹽主要指無機態的氮 ( N ) 和磷 ( P )，海水中對海藻P的供應比較穩定、通常不成為海藻生長的限制營養鹽，而N則是限制海藻生長的主要營養元素[12]。 因此在富營養化的海區，N的濃度顯著提高，這在一定程度上提高了大型海藻的生長速率[13]，本文結果也表明在N加富的情況下，緣管滸苔的生長速率得到顯著的提高，但在高濃度銅作用下的藻體，富營養化卻加劇了銅對生長的抑制，這體現了N與高濃度重金屬銅的耦合效應。生長是細胞內生物化學和生理學過程的綜合體現，從實驗結果可以看到，富營養化和高濃度重金屬銅共同作用的藻體，其光合作用能力、蛋白含量以及硝酸還原酶活性都顯著低于正常N水平作用下的藻體，雖然N加富提高了光合色素的水平，但也同時降低了類胡蘿卜素的含量，后者在過多光能的熱耗散方面發揮重要的作用，其綜合的結果是藻體的生長抑制率要明顯高于正常N水平下的藻體。

圖 5 在不同Cu處理（0，0.5和2 μM）以及兩種N水平（0和300 μM）培養下緣管滸苔可溶性蛋白含量的變化（圖中N0、N300分別表示培養海水中的兩種N水平：0和300 μM。）Fig. 5 Changes of soluble protein contents in Enteromorpha linza cultured at two different N availabilities（0 and 300 μM）and different Cu exposures(0, 0.5 and 2 μM). Means±SD (n=3).

重金屬銅對光合作用在很多大型海藻中都表現為抑制效應[3,4]，但也有一些研究表明，雖然銅導致了生長速率的下降，但對光合作用卻沒有明顯的影響[14]，這說明藻體在積累碳水化合物方面沒有受到銅的抑制，生長的抑制主要表現為由于細胞膜的損傷導致的細胞數目減少，或者是由于細胞的分裂受到抑制[15]，這主要體現在DNA復制以及細胞壁的形成受到銅的抑制[16]。本文結果表明，銅對緣管滸苔的光合作用存在明顯的抑制效應，尤其是在高濃度銅處理的情況下。而光合色素（Chla和Chlb）的含量并沒有受到銅的影響，甚至還有一定的增加。雖然一些研究表明銅是通過降低光合色素的含量來下調光合作用能力的[3,17]，但本實驗的結果說明銅是通過抑制其他的生理過程來降低光合作用的，銅有可能損傷光反應中心，抑制光系統II中的電子傳遞從而導致光合作用能力下降[18,19]。N加富在一定程度上提高了緣管滸苔的光合作用能力，這與N加富提高藻體的光合色素含量有一定的關系，這在藻體的光合效率方面表現最為顯著，色素含量的提高可以為藻體在低光的條件下獲得更多的光能，從而提高光合作用能力。而在高濃度銅的作用下，雖然N加富顯著提高了藻體的光合色素含量，但光合作用能力卻顯著下降，其中最有可能的原因就是N加富顯著降低了類胡蘿卜素的含量（圖4C），類胡蘿卜素和藻體過多光能熱耗散中的葉黃素循環密切相關，類胡蘿卜素含量的降低必然導致藻體的熱耗散能力下降，在藻體內過多光能導致的活性氧（ROS）可以顯著的破壞光系統反應中心，電子傳遞鏈組分受到損傷，從而導致光合作用的下降[20]。

除光合作用過程中產生的碳水化合物，藻體在生長的過程中還合成大量的蛋白質，蛋白質的合成和 N的供應有密切的關系，在海水中，NO3-是 N存在的主要形式，但如果要參與到藻體的N代謝過程，則必須轉化為NH4+，其中硝酸還原酶起到重要的作用，它是整個過程中的限速酶，它的活性直接決定藻體利用N的能力[21]。我們結果表明N加富顯著提高了蛋白的含量，這是因為在N加富的情況下，藻體的硝酸還原酶活性顯著增加（圖 3），這為藻體提供了大量的N源，從而使蛋白的含量顯著增加。硝酸還原酶的活性在底物NO3-濃度增加的情況下升高的現象在一些實驗中也得到證實[22]。但在高濃度銅的作用下，N加富卻顯著抑制了硝酸還原酶的活性，這樣使藻體蛋白含量顯著下降。而在較低濃度銅的作用下，正常海水N水平培養下藻體的硝酸還原酶活性顯著增加，而在N加富的情況下則存在相反的結果。這些現象說明，N和銅這兩種環境因素對藻體的硝酸還原酶活性存在耦合效應，它們之間彼此作用，濃度不同，效應也不同。

綜上所述，富營養化通過提供更多的N源，促進了蛋白質和光合色素的合成，使藻體的光合作用能力增加，從而導致生長速率增加；重金屬銅則通過降低藻體的光合作用速率以及蛋白含量抑制藻體的生長。當二者同時存在條件下，尤其在高濃度銅和富營養化的情況下，藻體的光合作用能力、硝酸還原酶活性、類胡蘿卜素含量以及蛋白含量都顯著下降，這導致生長的抑制最為顯著。兩種環境因素相互作用，不同的量導致不同的結果，它們之間的耦合作用的機制有待于進一步的研究。

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Responses ofEnteromorpha linzato the copper exposure under different N growth conditions

XU Jun-tian1, ZOU Ding-hui2, ZHU-Ming1, GUO Gan-lin1, LI Xin-shu1, LIU Shu-xia1

(1. School of Marine Science and Technology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang, 222005, China;
2. The Key Lab of Pollution Control and Ecosystem Restoration in Industry Clusters of Chinese Ministry of Education,College of Environmental Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou, 510006, China)

The ongoing coastal eutrophication and heavy metal pollution are becoming the question of marine environment with widespread concerns. The effects of copper exposure on the growth, photosynthesis, activity of nitrate reductase, pigments and soluble protein contents were investigated inEnteromorpha linzagrown at two different N availabilities. Our results showed that copper exposure both inhibited the relative growth rate (RGR) ofEnteromorpha linzaunder two different N growth conditions. The inhibition of the RGR increased with increasing level of copper concentrations. N-enrichment stimulated the growth of thalli under all copper exposure except for the highest level copper tested (2 μM). The photosynthetic rate and the activity of nitrate reductase of the thalli significantly decreased under N-enrichment and high level copper condition. N-enrichment significantly increased the contents of soluble protein of the thalli, but copper inhibited the synthesis of the protein and the lowest protein content was found in thalli cultured under N-enrichment and high level copper treatment.

Enteromorpha linza；copper；N；photosynthesis；relative growth rate

Q945.79

A

1001-6932(2010)06-0643-06

2010-06-09 ；收修改稿日期：2010-10-25

國家自然科學基金項目 (30970450)；教育部“新世紀優秀人才支持計劃”(NCET-10-0375)；連云港市發展項目 (SCH0810)

徐軍田（1979—），男，博士，講師，主要從事大型海藻生理生態的研究，電子郵箱：xjtlsx@126.com。

鄒定輝，教授，電子郵箱：dhzou@scut.edu.cn。