防腐劑復配優化抗藤黃微球菌研究

黃現青高曉平趙改名

（1.河南農業大學食品科學技術學院，河南 鄭州 450002；2.河南省肉制品加工與質量安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450002；3.雙匯集團技術中心，河南 漯河 462003）

防腐劑復配優化抗藤黃微球菌研究

黃現青1，2，3高曉平1，2趙改名1，2

（1.河南農業大學食品科學技術學院，河南 鄭州 450002；2.河南省肉制品加工與質量安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450002；3.雙匯集團技術中心，河南 漯河 462003）

選擇不同的防腐劑，通過藥敏紙片法、最小抑菌濃度（MIC）法測定藤黃微球菌對其敏感性，利用正交設計篩選最佳防腐劑組合，并對獲得的最佳防腐劑組合抑菌效果進行驗證。結果表明，藤黃微球菌對Nisin、聚賴氨酸、尼泊金乙酯較為敏感，MIC分別為0.078，0.039，0.125mg/mL。當 Nisin、聚賴氨酸和尼泊金乙酯濃度分別為 0.313，0.156，0.125mg/mL時，組合抑菌效果最佳，可使基質中藤黃微球菌降低2.7個數量級以上。選擇這一最佳組合在25℃和0～4℃條件下，可顯著抑制牛乳、里脊肉、獼猴桃果汁中藤黃微球菌的增殖。

防腐劑；藤黃微球菌；抑菌

藤黃微球菌廣泛分布于空氣、水、土壤中，是寄生于人體皮膚、咽部、眼睛等對人體無害的腐生菌，但機體抵抗力下降時，仍可引起各種感染，屬于條件致病菌［1］。近年來在抗生素選擇壓力下，條件致病菌日益增多，并且有繼續增高的趨勢［2］，因此對藤黃微球菌應引起高度的重視［3］。此外，由于抗性的增強，相應的也導致了其污染食品的機率，必須前瞻性的構建食品中藤黃微球菌的控制技術。

乳酸鏈球菌素（Nisin）、聚賴氨酸、山梨酸鉀、乳酸鈉、尼泊金乙酯均是食品中常用的防腐劑，但是抑菌特點不同［4］，鮮見關于復配防腐劑抑制藤黃微球菌效果的研究。鑒于藤黃微球菌對食品安全的威脅，以及復配可降低單一防腐劑過量使用的風險，本試驗用Nisin、聚賴氨酸、山梨酸鉀、乳酸鈉、尼泊金乙酯5種防腐劑來對藤黃微球菌的抑菌效果加以研究，并對防腐劑的最佳配比進行優化，旨在為商業應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

Nisin、聚賴氨酸、山梨酸鉀、乳酸鈉、尼泊金乙酯：浙江銀象生物工程有限公司；

牛肉浸膏、蛋白胨：北京雙旋WSW培養基制品廠；

平板計數瓊脂：北京奧博星生物技術有限責任公司；

藤黃微球菌標準株：中科院微生物所。

1.1.2 主要儀器

酶標儀：GF－M2000型，山東高密彩虹分析儀器有限公司；

高速冷凍離心機：GTR10－1型，北京時代北利離心機有限公司；

超凈工作臺：JB－CJ－2FD型，蘇州佳寶凈化工程設備有限公司；

電熱恒溫培養箱：DNP型，金壇市國旺實驗儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 培養基的配制 LB液體培養基（牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、氯化鈉0.5%、pH 7.2～7.4）、LB固體培養基（在 LB液體培養基中加入1.5%瓊脂粉）、平板菌落計數瓊脂（稱取23.5g加入到1L蒸餾水中加熱煮沸溶解后分裝），均于121℃ 滅菌15min，冷卻后備用。

1.2.2 細菌培養 取冰箱斜面保存藤黃微球菌活化后，接種到裝有100mL LB液體培養基的250mL三角瓶中，接種3瓶，于37℃恒溫搖床（120r/min）培養18h后，1瓶用于敏感性測定，另外2瓶在無菌條件下進行以下操作：3 000r/min離心15min收獲菌體；然后用50mL無菌生理鹽水懸浮，3 000r/min離心15min，收獲菌體；無菌生理鹽水漂洗重復3次后，再用無菌生理鹽水漂洗懸浮菌體，使細菌細胞濃度在105CFU/mL左右，備用。

1.2.3 敏感性測定 敏感性測定分別采用藥敏紙片法和最小抑菌濃度法（MIC），參照文獻［5］進行。

1.2.4 正交試驗設計 選取3種敏感性較高的防腐劑為試驗因子，以MIC值和食品最大添加量為參考選擇3水平，設計3因素3水平正交試驗。具體操作步驟為：首先按照試驗設計將復合防腐劑配制好，各取1mL分別裝入無菌試管中；然后各加入1.2.2制備的無菌生理鹽水懸浮菌液1mL，同時設立不添加防腐劑的空白對照，均于25℃條件下處理6h后，通過菌落平板計數法測定殘留存活藤黃微球菌細菌數量，評價防腐劑的抑菌效果，篩選最優防腐劑復配組合。

1.2.5 應用試驗 以肉、乳、果汁為基質，每100g各加入1.2.2培養后的藤黃微球菌1mL，然后加入經正交試驗優化后的復配防腐劑1mL。把樣品分別于25℃、0～4℃放置不同時間后，通過平板菌落計數法測定殘留存活細菌總數，研究其在不同食品介質中的防腐效果。

1.3 菌落計數

菌落總數的測定按照 GB/T 4789.2——2010，采用平板傾注法［6］。

2 結果與分析

2.1 敏感性測定結果

利用藥敏紙片法測定不同防腐劑對藤黃微球菌抑菌圈的大小，確定藤黃微球菌對不同防腐劑的敏感性，試驗結果見表1。

表1 抑菌圈直徑ńTable 1 Inhibition zone diameter /mm

由表1可知，Nisin、聚賴氨酸、尼泊金乙酯對藤黃微球菌有抑菌作用，在濃度為20mg/mL時抑菌圈直徑分別是11，10.5，7mm。

以96孔微量酶標板測定 MIC，利用GF－M2000酶標儀在492nm處測定吸光度值。結果表明，Nisin、聚賴氨酸、尼泊金乙酯的 MIC分別為0.078，0.039，0.25mg/mL。

2.2 正交試驗結果

參照各種防腐劑在食品中的應用限量以及其MIC值，考慮協同作用及減少防腐劑在食品中的添加量，設計防腐劑的水平，進行正交試驗設計（見表2）。表2中A/B兩個因子的水平是參照MIC值，在考慮了其食品添加限量的基礎上，以4倍比的梯度設立的，旨在能獲得最佳的抑菌效果。正交試驗結果及分析見表3。由表3可知，3種防腐劑抑菌性由強至弱依次為Nisin＞聚賴氨酸＞尼泊金乙酯，最優組合為Nisin 0.313mg/mL、聚賴氨酸0.156mg/mL、尼泊金乙酯0.125mg/mL。經驗證實驗（見表4）證明在此最優組合條件下，可顯著的抑制或殺滅藤黃微球菌。

表2 正交試驗因素與水平Table 2 Orthogonal factors and the level/（mg·mL－1）

2.3 應用試驗

室溫（25℃）及0～4℃處理3種樣品菌落計數結果見表5。由表5可知，3種樣品加入最佳復配防腐劑后，在室溫條件下可有效地減緩細菌的增殖。獼猴桃汁、里脊肉、牛乳中細菌數在經過4d放置后，僅僅分別增長3.14、2.85、0.67個數量級，顯著的低于沒有添加防腐劑的對照組。同樣的在0～4℃ 條件下，復配防腐劑抑菌效果更加明顯，獼猴桃汁、里脊肉和牛乳在放置5d后分別降低了1.3、0.6、1.3個數量級，而沒有添加防腐劑的對照組細菌數均有明顯的增加。3種樣品的腐敗速度以牛乳最快，而獼猴桃最慢，可能與獼猴桃中含有豐富的VC、果酸等成分，具有防腐效果有關［7］。

表3 正交試驗結果及分析Table 3 Orthogonal test results

表4 驗證試驗Table 4 Test validate

通過表5還可以看出，復配防腐劑在低溫條件下抑菌效果較好。這是因為在室溫條件下，細菌增殖較快，同時由于食品介質的影響，防腐劑抑菌效果會有所減弱。而在低溫條件下，細菌生長繁殖基本停止，復配防腐劑可表現出較好的抑菌效果，甚至具有一定的殺菌效果。

3 結論

研究結果表明Nisin、聚賴氨酸和尼泊金乙酯對藤黃微球菌具有明顯的抑菌效果。當其濃度為20mg/mL時，抑菌圈直徑分別為11，10.5，7mm；利用96微孔板法測得其 MIC分別為0.078，0.039，0.125mg/mL；通過正交試驗獲得其最佳復配比例為：乳酸鏈球菌0.313mg/mL、聚賴氨酸0.156mg/mL和尼泊金乙酯0.125mg/mL，在此復配比例下，可使基質中藤黃微球菌降低2.7個數量級以上。

表5 食品介質應用試驗結果ńTable 5 Application test results of different food medium /（CFU·mL－1）

通過在不同食品介質中驗證性實驗，表明在25℃貯藏時可以有效抑制細菌的增殖，可保障獼猴桃汁、里脊肉、牛乳在經過4d放置后，細菌總數僅僅分別增長3.14、2.85、0.67個數量級。而在0～4℃放置時3種樣品中細菌總數都顯著減少，貯藏5d后分別降低了1.3、0.6、1.3個數量級。通過系統研究，獲得了有效的防腐劑復配組合，為其在食品中的應用提供了理論依據。

復配可降低單一防腐劑的用量，也是本試驗的主要目的之一。單一防腐劑的MIC卻明顯低于復配中劑量的原因為：由于測定MIC使用的是LB液體培養基，對防腐劑抑菌效果影響極小，而在食品介質中成分較為復雜，微生物種類較多，對防腐劑的抑菌效果影響較大，所以優化試驗以MIC值為基數，按照倍比的方法設計的試驗梯度（同時也考慮到了各種防腐劑在食品中的添加限量）。雖然看復配防腐劑濃度比MIC值高出很多，但是還是比食品中防腐劑添加劑量有較大的降低。

1 宗淑杰，吳明江，秦銀河，等.醫家金鑒·檢驗醫學卷（下）［M］.北京：軍事醫學科學出版社，2007：300.

2 曾鋒，張立彥，曾慶孝.微生物對食品防腐劑的抗藥性研究進展［J］.食品與機械，2005，21（2）：51～53.

3 姜梅杰，魏緒廷.顱腦外傷患者腦脊液中檢出藤黃微球菌一例［J］.中華神經外科雜志，2005，21（12）：735.

4 張鷹，曾新安，溫其標.生物防腐劑及其在食品中的應用［J］.食品與機械，2006，22（1）：77～79.

5 黃現青，別小妹，呂鳳霞，等.枯草芽孢桿菌fmbJ產脂肽抑制點青霉效果及其桃防腐試驗［J］.農業工程學報，2008，24（1）：263～267.

6 中華人民共和國衛生部.GB/T4789.2——2010食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定［S］.北京：中國標準出版社，2010.

7 徐幸蓮，彭增起，鄧桑貴.食品原料學［M］.北京：中國計量出版社，2006：116～120.

Study on sterilization of optimization of preservative combination againstmicrococcus luteus

HUANG Xian－Qing1，2，3GAO Xiao－Ping1，2ZHAO Gai－Ming1，2

（1.College of Food Science and Technology，Henan Agricultural University，Zhengzhou，Henan450002，China；2.Henan Key Laboratory of Meat Processing and Quality Safety Control，Zhengzhou，Henan450002，China；3.Technology Center of Shineway Group，Luohe，Henan462003，China）

The inhibitive effect onmicrococcus luteusthrough the determination of the sensitivity，minimum inhibitory concentration （MIC），orthogonal experimental optimization and application effect experiment with different preservative were studied in the paper.The results showed thatmicrococcus luteusare are sensitive to nisin，ε－polylysine and ethylparaben with MIC 0.078mg/mL，0.039mg/mL，0.125mg/mL respectively.The sterilization effect onmicrococcus luteuswas best when concentrations of the nisin，ε－polylysine and ethylparaben were 0.313mg/mL，0.156mg/mL，0.125mg/mL respectively，the bactericidal effect was best combination conditions，and depress 2.7orders ofmicrococcus luteusin food medium.That could significantly inhibitmicrococcus luteusmultiplication in the milk，meat，syrup of Chinese goosebeery when select the best preservative combination at 25℃and at 0～4℃.

preservative；micrococcus luteus；inhibition

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.06.001

公益性行業（農業）科研專項經費項目（編號：200903012）；河南省基礎與前沿技術研究計劃項目（編號：082300430050）

黃現青（1977－），男，河南農業大學副教授，博士。E－mial：hxq8210＠126.com

趙改名

2010－06－01