丙戊酰酪氨酸二肽Tyr-Tyr-VPA的固相合成*

伍江卓, 盧 奎,2, 趙東欣, 薛永亮, 王宏慧

(1. 河南工業(yè)大學 化學化工學院,河南 鄭州 450001; 2. 河南工程學院，河南 鄭州 451191)

多肽是涉及生物體內(nèi)各種細胞功能的生物活性物質，可被廣泛的用于醫(yī)療、衛(wèi)生、保健、食品，化妝品等方面[1～5]。多肽的全合成不僅具有重要的理論意義，而且具有重要的應用價值，對化學、生化[6]、醫(yī)藥、免疫[7]及微生物學等領域都起了巨大的推動作用。

丙戊酸鈉為抗癲癇藥，在醫(yī)藥上用途很廣，具有抑制肺癌細胞株增殖功能，有望用于治療惡性腫瘤[8]。但丙戊酸鈉對胃腸道有刺激性，吸收快，血濃度波動大，將其羧基修飾為酰胺基，形成丙戊酰胺，則毒性減小，吸收較慢，血濃度波動范圍小。

本文設計并合成了丙戊酰酪氨酸二肽(Tyr-Tyr-VPA)，期望得到副作用更小的抗癲癇藥物。以Wang樹脂為固相載體，F(xiàn)moc-為α-氨基保護基，HBTU-HOBT為縮合劑，采用固相法合成了Tyr-Tyr-VPA(Scheme 1)，粗產(chǎn)率86.7%,其結構經(jīng)IR和ESI-MS表征。

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

島津IR-Prestige 21型傅立葉變換紅外光譜儀;Agilent 6310型離子阱液相色譜-質譜儀;Agilent 1100型高效液相色譜儀。

丙戊酸,純度99.7%，鹽城東陽生物制品有限公司；乙腈，色譜純，TEDIA公司；氨基酸藥品、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU),一羥基苯并三唑(HOBt)，N,N-二異丙基乙胺(DIEA)， Fmoc-Tyr(tBu) Wang Resin(1,擔載量0.53 mmol·g-1)， Fmoc-Tyr(tBu)-OH，三氟乙酸(TFA)和茚三酮,吉爾生化(上海)有限公司； 其余所用試劑均為分析純。

?=Wang Resin

1．2 合成

(1) 脫Fmoc-保護

在固相合成管中加入Fmoc-1 500 mg, DMF 7.5 mL，靜置溶脹30 min。抽濾，濾餅加入20%哌啶的DMF溶液7.5 mL,振蕩30 min,抽濾,濾餅再加入20%哌啶的DMF溶液7.5 mL,振蕩90 min，抽濾，濾餅用DMF(10×7.5 mL)洗滌(每次不少于1 min)得脫Fmoc-保護的1。

在小試管中加入1(4 mg～5 mg),滴加3滴茚三酮溶液，100 ℃水浴加熱3 min，呈紫色或黑色為陽性，說明有游離的氨基存在，F(xiàn)moc-脫除完全；若無色或顏色較淺為陰性，表明Fmoc-脫除不完全，需重復脫Fmoc-保護過程至1呈陽性。

(2) 縮合

在試管中加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH 365 mg, HOBT 107 mg, HBTU 302 mg和DMF 7.5 mL,振蕩使其完全溶解后加入DIEA 263μL，混勻，室溫下避光靜置2 min～3 min得活化Fmoc-Tyr(tBu)-OH溶液。

將活化Fmoc-Tyr(tBu)-OH溶液加入1中，于室溫氮氣吹動反應4 h，抽濾，濾餅用DMF(8×7.5 mL)洗滌(每次不少于1 min)，抽干得Fmoc-Tyr-1(Fmoc-2)(用Kaiser法監(jiān)控至縮合反應進行完全)。

用類似1.2(1)方法對Fmoc-2進行脫Fmoc-保護得2。

將活化丙戊酸0.114 g加入2中，于室溫氮氣吹動反應4 h，抽濾，濾餅依次用DMF(3×7.5 mL),甲醇(3×7.5 mL)和二氯甲烷(3×7.5 mL)洗滌(每次洗滌不少于1 min)，抽干,用氮氣吹干得淺黃色固體2-VPA(用Kaiser法監(jiān)控至縮合反應進行完全)0.5 g,粗產(chǎn)率86.7%。

(3) 樹脂切割

在燒瓶中加入樹脂切割試劑[V(TFA) ∶V(三異丙基硅烷) ∶V(水)=95.0 ∶2.5 ∶2.5] 10 mL和2-VPA，磁力攪拌下于室溫反應3 h。用砂芯漏斗濾入冰乙醚中，濾液在冰箱中靜置2 h,離心收集沉淀得粗肽Tyr-Tyr-VPA。

(4) 純化

用反相HPLC法純化粗肽Tyr-Tyr-VPA, Eclipse XDB C18 5μm(150 mm×4.6 mm),柱溫20 ℃，流動相:A=V(水) ∶V(乙腈)，梯度洗脫,基線:A=60 ∶40, 0 min～30 min: A=30 ∶70;檢測波長254 nm，流速1 mL·min-1, tR=6.8 min。收集液旋蒸除去乙腈，冷凍干燥得白色粉末Tyr-Tyr-VPA。IRν: 3 297(O-H), 2 957(C-C), 1 637(C=O), 1 538, 1 513, 1 458(Ph), 1 240(C-O) cm-1; MSm/z: 470.8{[M+H]+}。

2 結果與討論

本實驗采用多肽固相合成法，選用Wang樹脂為固相載體，以Fmoc-為α-氨基保護基，HBTU-HOBT為縮合劑，合成了丙戊酰酪氨酸二肽Tyr-Tyr-VPA，粗產(chǎn)率86.7%，粗產(chǎn)物用RP-HPLC進行制備。實驗中，為了增加產(chǎn)率和縮短反應時間，可以延長脫Fmoc-保護和縮合反應時間，使每次洗滌時間減少至1 min。

不同的氨基酸保護基不同，需要選擇不同的脫側鏈和樹脂切割方法，2-VPA的樹脂切割試劑為TFA/三異丙基硅烷/水混合溶液。酪氨酸是疏水性氨基酸，濾入冰乙醚之后不出現(xiàn)沉淀，可以直接將冰乙醚旋蒸干，用甲醇溶解后進行反相HPLC純化。

本方法反應條件溫和，收率較高。

[1] 霍長虹,趙冬梅,張雅芳. 組合化學中的固相合成法[J].中國藥物化學雜志,1998,8(3):228-234.

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