響應面法優化沙棘中熊果酸提取工藝

魯長征,山永凱,李樹志,任蓓蕾

(青海清華博眾生物技術有限公司,青海西寧 810016)

沙棘屬于胡頹子科沙棘屬植物,又名酸刺、醋柳。遍布歐亞大陸的溫帶地區,我國是沙棘資源最豐富的國家,主產于西南、西北等地[1]。研究表明,沙棘的根、莖、葉、花、果中含有糖類、V C、VE、多種氨基酸、亞油酸、黃酮類化合物、磷脂類化合物以及甾醇類化合物等200多種營養物質,其中具有抗炎抗菌、抗肝炎、抗氧化、降血糖等多種藥理活性的物質——熊果酸,由于其獨特的生物活性和對癌癥的功能作用[2,3],近年來成為沙棘研究的熱點,從沙棘果實加工的殘渣中提取高純度的熊果酸在國內還未見報道。青海沙棘因其生長于高原地區,品質較內地更優。為充分利用當地豐富的沙棘資源,本次實驗利用RSM分析法,以提取果汁和沙棘種籽后的沙棘果皮渣為原料,得出提取熊果酸的最佳工藝參數,以期望為熊果酸的工業化生產提供一定理論依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

沙棘果皮渣 (產于青海)于105℃烘箱中烘干,粉碎,過篩,備用。

1.2 試劑

95%乙醇、丙酮、乙酸乙酯、蒸餾水、熊果酸標準品、甲醇、乙酸等,均為分析純。

1.3 儀器

FW-400A傾斜式高速萬能粉碎機、BS323S型分析天平、HS.2型電熱恒溫水浴鍋、PB-10酸度計、RE-52A旋轉蒸發儀、SHB-3循環水多用真空泵、DG/20-002臺式干燥箱等。

1.4 方法

1.4.1 提取路線

1.4.2 提取方法

準確稱取原料5g,按1∶40加氯仿回流3h脫脂,回收溶劑,殘渣揮發干溶劑,按料液比1∶20加入夾帶劑,按照一定萃取壓力、萃取溫度、CO2流量、原料粒度進行超臨界CO2萃取,最后離心得提取液,即為熊果酸粗提液。

1.4.3 熊果酸的測定

1.4.3.1 色譜條件

色譜柱:Luna 5u C18(2),250mm ×4.6mm;Shimpack VP-ODS,150mm×4.6mm,5μm;檢測波長為215nm;流動相為0.1mol/L,甲醇∶冰醋酸 (體積比為85∶15);流動相流速為0.8ml/min,柱溫為25℃;進樣量:20μl;數據處理為外標法峰面積定量。

1.4.3.2 標準對照溶液配制

稱取熊果酸標準樣品 24.0mg,置于 10ml容量瓶中,甲醇溶解并稀釋至刻度,得含熊果酸2.40mg/ml的標準溶液。分別精密吸取標準溶液 0.10、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00ml,置于5ml量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,進樣20μl,測定峰面積。以峰面積平均值為縱坐標,其對應進樣質量濃度為橫坐標,進行回歸計算,得線性方程為:

熊果酸濃度在 35～1120μg/ml,線性關系良好。

1.4.3.3 樣品溶液的制備

移取 1ml熊果酸提取液,用甲醇定容至25ml,用微孔濾膜 (0.45μm)濾過,精密吸取10μl,按上述色譜條件進行測定。重復進樣3次,取均值,根據回歸方程計算熊果酸的量。

1.5 試驗方案

1.5.1 單因素試驗

主要分析夾帶劑、萃取壓力、萃取溫度、CO2流量、原料粒度5個單因素對熊果酸浸出率的影響。單因素實驗水平見表1。

表1 單因素實驗水平

1.5.2 響應面分析試驗

根據Box-Benhnken中心組和試驗設計原理[4,5],采用三因素三水平的響應面分析方法,根據單因素試驗結果選取因素水平。試驗因素水平設計見表2。

2 結果與分析

表2 試驗因素水平

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 夾帶劑對熊果酸浸出率的影響

在進行預實驗時,不加夾帶劑時,熊果酸的提取效果很差,通過檢測,沒有或者只有少量熊果酸浸出,因此,必須加入夾帶劑。但夾帶劑的加入量要適當,如果量太少,起不到作用,但量過多會改變萃取性質,使萃取主要在非臨界的液態下進行,這樣往往達不到理想的萃取效果。由圖1可見,95%乙醇的熊果酸浸出率比其他溶劑高,而且95%乙醇價格低廉、原料豐富、安全可靠,適合工業化生產,故選擇95%乙醇作夾帶劑,加入量為物料干質量的30%。

2.1.2 萃取壓力對熊果酸浸出率的影響

由圖2可以看出,在其它參數固定的條件下,萃取率隨萃取壓力的升高而增大,在5～20 MPa之間這種增加較為明顯,超過20MPa時,萃取率增大不明顯。考慮到過高的壓力不僅對設備和操作提出更高的要求,生產成本也會相應增加,因此綜合考慮萃取壓力選擇20MPa。

2.1.3 萃取溫度對熊果酸浸出率的影響

由圖3可以看出,萃取溫度在25～40℃之間,隨溫度升高熊果酸浸出率增大,但在45℃時,熊果酸浸出率反而下降。這可能是因為繼續升溫時,CO2密度降低,其溶解能力也相應降低,使浸出率下降;再者因為溫度過高會對熊果酸有一定程度的破壞。故最佳萃取溫度選擇40℃。

2.1.4 CO2流量對熊果酸浸出率的影響

CO2流量是影響浸出率的一個重要因素。一方面CO2流量增加,超臨界CO2在萃取器中的停留時間減少,使流體與有效成分接觸時間減小,萃取平衡受到影響;另一方面,流體流量增加,增加了流體的擾動,使傳質速度加快,有利于萃取速率及萃取率的提高。隨著CO2流量的增大,萃取率也增大。但流量若過大,與物料接觸不夠充分,萃取率會逐漸趨于緩和,且流量的增大會增加操作費用。綜合考慮,流量選擇20L·h-1為宜。

2.1.5 原料粒度對熊果酸浸出率的影響

由于粒度直接影響到熊果酸提取的操作周期和浸出率。粒度大小直接與總表面積和固相傳質系數有關。粒度越小,總表面積越大,傳質越快,與流體接觸面積越多,浸出率越高。從圖5可知,隨物料粒度變小,浸出率不斷提高,但從20～100目萃取率提高幅度不大,考慮到工業上粉碎的難度和能耗,綜合分析,選擇最佳粒度為80目。

2.2 響應面試驗結果與分析

2.2.1 試驗結果

選取萃取壓力、萃取溫度、CO2流量作為自變量,以熊果酸浸出率為響應值Y,試驗設計與結果見表3。其中1～12是析因試驗,13～15是中心試驗,用來估計實驗誤差[6]。

表3 試驗設計與結果

2.2.2 回歸方程及方差分析

熊果酸浸出率 (Y)與萃取壓力 (X1)、萃取溫度 (X2)、CO2流量 (X3)三因素之間的反應曲面擬合方程為:

用F值檢驗來判定,概率P值越小,其相應變量的顯著性越高。從表4中可以看出,方程一次項、二次項的影響都是顯著的,交互項影響不顯著,故交互項可以省略。因此,各具體試驗因子對響應值的影響并不是簡單的線性關系。方程復相關系數的平方R2=90.89%,說明響應值的變化有90.89%來源于所選變量,可以用此模型對熊果酸浸出率進行分析。在所選的各因素水平范圍內,按照對結果的影響排序:X3＞X1＞X2,即:CO2流量＞萃取壓力＞萃取溫度。

表4 回歸方程的方差分析

2.2.3 等高線圖與響應面圖分析

比較3組圖可知:CO2流量對熊果酸浸出率的影響最為顯著,其次是萃取壓力,表現為它們的曲線都較陡,而萃取溫度的改變對熊果酸浸出率的影響相對較小,曲線變化較為平滑。

2.2.4 基于實驗編碼值的響應值的典型分析結果

?

穩定點的估計值為：378.9941。

?

從典型分析表6中可以看出，特征值均為負值,穩定點位最大值,即在點 (0.50709,0.08177,0.66305)處響應值對應最大值。所以利用超臨界CO2提取熊果酸的最佳提取條件為:萃取壓力為 22.5MPa,萃取溫度為 40.4℃、CO2流量為23.3L·h-1。在此條件下熊果酸浸出率為:374mg/100g,與實驗預測值378.9941非常接近。

3 小結

實驗證明運用RSM方法對沙棘中熊果酸的提取工藝進行優化是非常有效的。通過響應面分析法建立各因素與響應值之間的數學模型,可以直觀地看出各因素及各因素之間的作用,進而對最佳制備工藝參數有很大幫助,提高了工作效率。

熊果酸的提取工藝最佳參數為:萃取壓力為22.5MPa,萃取溫度為 40.4℃、CO2流量為23.3L·h-1。在此條件下熊果酸浸出率為:374mg/100g,與實驗預測值378.9941非常接近。

[1]顧晶晶,王愛芹,康健.響應面方法研究新疆大果沙棘的果酒釀造工藝[J].食品工業科技,2008,8:224-226.

[2]鄭艷,蘇丹.女貞子中熊果酸的提取工藝研究[J].陜西科技大學學報,2008,8,(4):85-88.

[3]李釤,王亞楠,萬梓龍,等.山楂中熊果酸與齊墩果酸提取和純化工藝的研究 [J].食品科學,2007,7(28):141-144.

[4]張鳴鏑,王章存.響應面分析法優化玉米胚芽蛋白的提取工藝研究 [J].農產品加工,2008,7(142):174-178.

[5]楊芙蓮,任蓓蕾,夏銀.陜北蕎麥殼中生理活性成分的研究 [J].食品科學,2007,12(28):156-161.

[6]姚凌云,宋玉喬,李教社,等.中國沙棘葉化學成分的研究 (Ⅱ)[J].沙棘,2002,2(16):33-34.