胰腺癌中GLI1、PTCH1 mRNA的表達及其與臨床指標相關性分析

郭杰芳 高軍 李兆申 龔燕芳 金晶 滿曉華 吳紅玉

·論著·

胰腺癌中GLI1、PTCH1 mRNA的表達及其與臨床指標相關性分析

郭杰芳 高軍 李兆申 龔燕芳 金晶 滿曉華 吳紅玉

目的檢測胰腺癌組織中GLI1、PTCH1 mRNA的表達情況,探討其臨床意義。方法應用實時熒光定量PCR方法檢測35例胰腺癌組織及27例癌旁正常胰腺組織中GLI1、PTCH1 mRNA的表達，并分析它們與相關臨床指標的關系。結果胰腺癌組織GLI1 mRNA相對表達量為1.12～3.65，中位數為1.19；PTCH1 mRNA相對表達量為1.82～4.36，中位數為2.36。癌旁正常胰腺組織的GLI1 mRNA相對表達量為0.23～2.76，中位數為0.87；PTCH1 mRNA相對表達量為1.11～2.17，中位數為0.58。癌組織GLI1、PTCH1 mRNA的表達量均顯著高于癌旁正常胰腺組織(P<0.05)，且GLI1 mRNA與PTCH1 mRNA的表達水平呈正相關(r=0.532，P<0.05)；GLI1 mRNA的表達水平與胰腺癌的分化程度及淋巴結轉移相關(P<0.05)。結論GLI1、PTCH1基因參與胰腺癌的發生；GLI1的表達與胰腺癌的侵襲及淋巴結轉移有關。

胰腺腫瘤； GLI1； PTCH1； 腫瘤侵襲； 腫瘤轉移

目前研究發現，Hedgehog信號通路(Hh信號通路)的異常激活與胰腺癌的發生發展密切相關[1-2]。PTCH1、GLI1分別是該通路的跨膜蛋白質受體及下游的轉錄激活因子，兩者在該通路的信號轉導中發揮著非常重要的作用。本實驗檢測胰腺癌組織中GLI1、PTCH1 mRNA的表達情況，分析其與胰腺癌臨床指標的相關性，為臨床開發診斷與治療胰腺癌的新方法提供一定實驗依據。

材料和方法

一、臨床資料

收集2004年4月至2006年5月我院外科手術切除并經術后病理證實的35例胰腺癌患者。所有病例均有完整的手術記錄及臨床資料。其中男23例，女12例，年齡42～75歲，平均60歲。腫瘤最大徑≤3 cm 15 例, >3 cm 20 例；高分化13例，中低分化22例；淋巴結轉移17例，未轉移18例；遠處轉移14例，無遠處轉移21例。術中獲取的胰腺癌組織立即置于液氮凍存，同時獲取的27例癌旁正常胰腺組織(距腫瘤邊緣>5 cm)也置液氮凍存作為對照。本研究經上海第二軍醫大學附屬長海醫院道德倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

二、GLI1、PTCH1 mRNA的檢測

取凍存的胰腺癌或癌旁組織標本約100 mg，研磨成粉末狀，按3S Trizol總RNA抽提試劑盒(美國Invitrogen公司)說明書抽提組織總RNA，紫外分光光度計測定總RNA的純度與濃度。按逆轉錄試劑盒(上海晶美生物工程有限公司)說明書逆轉錄成cDNA。再在Lightcycler 2.0 system 熒光定量PCR儀(Roche Diagnostics Ltd)上行實時定量PCR檢測GLI1 mRNA 及PTCH1 mRNA。根據GLI1及PTCH1序列自行設計引物， GLI1上游引物為5′-TGTGTATGAAACTGACTGCCG-3′，下游引物為5′-CCCAGTGGCACACGAACTC-3′，產物長度125 bp；PTCH1上游引物為5′-TGTGCGCTGTCTTCCTTCTG-3′，下游引物為5′-CACGGCACTGAGCTTGATTC-3′，產物長度119 bp；內參照β-actin上游引物為5′-GCCATCCTGCGTCTG-3′，下游引物為5′-TGGGCACCGGAACCGCT-3′，產物長度260 bp。引物由上海生工生物工程公司合成。PCR反應條件： 95℃ 30 s， 95℃ 5 s、55℃ 20 s、72℃ 20 s，共40個循環。融解曲線分析 95℃ 0 s、65℃ 15 s、95℃ 20 s。以相對定量法(ΔΔCT法)計算GLI1、PTCH1 mRNA的表達量。

三、統計學分析

采用SPSS 14.0軟件進行統計。兩組目的基因表達量的比較采用Mann-WhitneyU檢驗；相關性分析采用Spearman秩相關檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、胰腺癌及癌旁正常組織GLI1、PTCH1 mRNA的表達

35例胰腺癌標本及27例癌旁正常組織均可檢測到GLI1、PTCH1 mRNA的表達。胰腺癌組織GLI1 mRNA相對表達量為1.12～3.65，中位數為1.19；PTCH1 mRNA相對表達量為1.82～4.36，中位數為2.36。癌旁正常胰腺組織的GLI1 mRNA相對表達量為0.23～2.76，中位數為0.87；PTCH1 mRNA相對表達量為1.11～2.17，中位數為0.58。癌組織GLI1、PTCH1 mRNA的表達量均顯著高于癌旁正常胰腺組織(P<0.05， 圖1、2)。胰腺癌組織中GLIl mRNA的表達量與PTCH1 mRNA的表達量呈正相關(r=0.532，P<0.05)。

圖1胰腺癌及癌旁正常胰腺組織中GLI1 mRNA的相對表達量

圖2胰腺癌及癌旁正常胰腺組織中PTCH1 mRNA的相對表達量

二、GLI1、PTCH1 mRNA的表達與胰腺癌臨床指標的相關性

GLI1 mRNA的表達量與胰腺癌的分化程度、有無淋巴結轉移相關(r=0.312，P<0.05；r=0.298，P<0.05)，與腫瘤大小、有無遠處轉移無關。PTCH1 mRNA的表達量與腫瘤大小、分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移均無關(P>0.05，表1)。

表1胰腺癌GLI1、PTCH1 mRNA表達量與腫瘤臨床指標的相關性分析

臨床指標GLI1mRNA表達量r(P)PTCH1mRNA表達量r(P)腫瘤大小0.176(0.172)0.125(0.213)分化程度0.312(0.035)0.152(0.185)淋巴結轉移0.298(0.041)-0.139(0.207)遠處轉移0.107(0.276)-0.064(0.324)

討 論

胰腺癌惡性程度高，進展迅速，大多數患者就診時已發生遠處轉移，失去手術切除的機會，預后極差。因此積極探索胰腺癌發生、發展的分子機制具有非常重要的意義。近年來研究發現，Hh信號通路與多種惡性腫瘤(包括胰腺癌)的發生及發展密切相關。哺乳動物Hh通路是由HH 配體、兩個跨膜蛋白質受體PTCH和SMO所構成的復合物及下游的轉錄因子GLI蛋白等組成。在沒有HH配體刺激時,PTCH抑制了SMO的活性。當HH與PTCH結合后，PTCH對SMO的抑制作用被解除，SMO進入胞內，激活下游轉錄因子GLI蛋白進入核內調控多種靶基因的表達。GLI1是該通路末端具有很強的激活功能的轉錄因子之一，可將細胞外的HH信號向胞核內傳遞，從而啟動下游靶基因的轉錄。PTCH1既是該通路的跨膜蛋白質受體，又是該通路的靶基因之一。因此，PTCH1、GLI1是該通路的兩個重要成員，是反映Hh通路活性程度的可靠指標[3]。

本研究采用實時定量PCR的方法檢測胰腺癌及癌旁正常胰腺組織中GLI1、PTCH1 mRNA的表達，結果顯示胰腺癌組織中GLI1、PTCH1 mRNA的表達量均顯著高于癌旁正常胰腺組織，提示胰腺癌組織中存在著Hh通路的過度激活，這與前期研究結果一致[4-5]。本實驗結果還顯示，GLI1 mRNA的表達量與PTCH1 mRNA表達量呈正相關，推測這可能與PTCH1是Hh通路的下游靶基因有關，進一步證實GLI1、PTCH1可作為評估Hh通路活性程度的可靠指標。

Xuan等[6]應用免疫組化法檢測乳腺癌組織中Hh通路成員，結果Ihh、GLI1,2,3的表達水平與其淋巴結轉移顯著相關，且Ihh、PTCH、GLI2與其臨床分期相關，提示Hh通路在乳腺癌的淋巴路播散和進展中起重要作用。Gialmanidis等[7]檢測了非小細胞肺癌中Hh通路成員的表達，發現淋巴結轉移陽性組SMO的表達陽性率顯著高于淋巴結轉移陰性組，提示Hh通路與其淋巴結轉移相關。本實驗的相關性分析顯示，GLI1 mRNA的表達量與胰腺癌的分化程度、淋巴結轉移顯著相關，提示Hh通路可能參予了胰腺癌的侵襲及淋巴路的轉移，與文獻報道的結果一致。但有關該通路在促進腫瘤侵襲與淋巴轉移的具體作用機制還有待于進一步深入研究。

[1] Hidalgo M,Maitra A.The hedgehog pathway and pancreatic cancer.N Engl J Med,2009,361:2094-2096.

[2] Katoh Y,Katoh M.Hedgehog target genes:mechanisms of carcinogenesis induced by aberrant hedgehog signaling activation.Curr Mol Med,2009,9:873-886.

[3] Katoh Y,Katoh M.Hedgehog target genes: mechanisms of carcinogenesis induced by aberrant hedgehog signaling activation.Curr Mol Med,2009,9:873-886.

[4] Shao J,Zhang L,Gao J,et al.Aberrant expression of PTCH (patched gene) and Smo (smoothened gene) in human pancreatic cancerous tissues and its association with hyperglycemia.Pancreas,2006,33:38-44.

[5] Gao J,Li Z,Chen Z,et al.Antisense Smo under the control of the PTCH1 promoter delivered by an adenoviral vector inhibits the growth of human pancreatic cancer.Gene Ther,2006,13:1587-1594.

[6] Xuan Y,Lin Z.Expression of Indian Hedgehog signaling molecules in breast cancer.J Cancer Res Clin Oncol,2009,135:235-240.

[7] Gialmanidis IP,Bravou V,Amanetopoulou SG,et al.Overexpression of hedgehog pathway molecules and FOXM1 in non-small cell lung carcinomas.Lung Cancer,2009,66:64-74.

2010-03-03)

(本文編輯：呂芳萍)

ExpressionofGLI1andPTCH1mRNAandytscorrelationwithclinicalparametersinpancreaticcancer

GUOJie-fang,GAOJun,LIZhao-shen,GONGYan-fang,JINJing,MANXiao-hua,WUHong-yu.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

Correspondingauthor：LIZhao-shen,Email：lizhaoshen111@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the expression of GLI1 and PTCH1 mRNA in pancreatic cancer and study its clinical significance.MethodsReal-time fluorescence quantitative PCR (RFQ-PCR) was used to detect the expression of GLI1 and PTCH1 mRNA in 35 samples of pancreatic cancer tissues and 27 samples of adjacent normal pancreatic tissues, and the correlation of GLI1 and PTCH1 mRNA expression with clinical parameters was investigated.ResultsThe relative expression of GLI1 mRNA in pancreatic cancer tissues was 1.12～3.65 (median 1.19), the relative expression of TCH1 mRNA was 1.82～4.36 (median 2.36). The relative expression of GLI1 mRNA in adjacent normal pancreatic tissues was 0.23～2.76 (median 0.87), the relative expression of PTCH1 mRNA was 1.11～2.17 (median 0.58). Both the expression of GLI1 and PTCH1 mRNA in pancreatic cancer tissues were significantly higher than those in normal pancreatic tissues(P<0.05), and a positive correlation was found between GLI1 and PTCH1 mRNA expression levels (P<0.05).The expression of GLI1 mRNA was significantly correlated with the differentiation degree and lymph node metastasis of pancreatic cancer (P<0.05).ConclusionsGLI1 and PTCH1 may be involved in pancreatic carcinogenesis, and GLI1 may be related to invasion and lymph node metastasis of pancreatic cancer．

Pancreatic neoplasms； GLI1； PTCH1； Neoplasm invasiveness； Neoplasm metastasis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.03.016

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院消化內科

李兆申，Email:lizhaoshen111@yahoo.com.cn