柴胡皂苷d對人胰腺癌細(xì)胞IkB激酶β表達(dá)的影響

吳葆瑩 吳崇旭 張志翔 劉彤

柴胡皂苷d對人胰腺癌細(xì)胞IkB激酶β表達(dá)的影響

吳葆瑩 吳崇旭 張志翔 劉彤

越來越多的研究表明，IκB激酶(inhibit kappa B kinase, IKK)的表達(dá)異常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用[1-3]。中藥柴胡具有明顯的抗腫瘤作用，但是其具體作用機制不清。因此，本研究觀察柴胡主要藥理成分——柴胡皂苷d(Saikosaponin d, SSd)對人胰腺癌細(xì)胞IKK-β表達(dá)和凋亡的影響，為胰腺癌的治療提供新思路。

一、材料和方法

1．材料：人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1購自意大利IST-Banca公司，DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均為美國Gibco公司產(chǎn)品；Trizol購自美國invitrogen公司，cDNA第一鏈合成試劑盒和PCR試劑盒均購自天根生物技術(shù)有限公司；IKK-β兔抗大鼠單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG均為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。

2．細(xì)胞培養(yǎng)與分組：PANC1細(xì)胞置無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，800 r/min離心5 min，棄上清；加入含150 ml/L胎牛血清、35.76 g/L HEPES和青、鏈霉素各100 U/ml的DMEM完全培養(yǎng)液，置5% CO2、37℃孵箱里貼壁生長至融合，隔日換液。待細(xì)胞生長至80%～90%融合時，用1.25 g/L胰蛋白酶消化傳代。以1×104/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。將細(xì)胞隨機分為低、中、高劑量SSd組和對照組，分別加入終濃度為0.625 mg/L、1.25 mg/L、2.50 mg/L的SSd和PBS繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。

3．細(xì)胞IKK-β mRNA水平檢測：Trizol提取各組細(xì)胞總RNA，取2 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA。IKK-β上游引物5′-AGATCGCCTGTAGCAAA-3′，下游引物5′-CTCCAGTCT-AGGGTCGTG-3′，擴(kuò)增片斷244 bp；內(nèi)參β-actin上游引物5′-GTTGACATCCGTAAAGACC-3′，下游引物5′-TCATCGTACTCC-TGCTTG-3′，擴(kuò)增片斷233 bp。引物由金思特科技有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s、54℃ 40 s、72℃ 1 min，30個循環(huán)，最后72℃ 5 min。產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比作為mRNA相對表達(dá)量。

4．細(xì)胞IKK-β蛋白表達(dá)檢測：提取各組細(xì)胞總蛋白，常規(guī)行Western blotting檢測。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值比作為IKK-β蛋白表達(dá)量。

5．細(xì)胞凋亡檢測：采用TUNEL法檢測。計數(shù)7個陽性細(xì)胞數(shù)最多的高倍視野的細(xì)胞，計算凋亡指數(shù)(apoptotic index, AI)。AI=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

二、結(jié)果

1．IKK-β mRNA和蛋白表達(dá)的變化：中、高劑量組細(xì)胞IKK-β mRNA水平、蛋白表達(dá)顯著低于低劑量組與對照組(P值均<0.05，圖1、表1)，中、高劑量組之間以及低劑量組與對照組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。

圖1 IKK-β PCR產(chǎn)物電泳圖(a: IKK-β;b:β-actin)

組別IKK-βmRNAIKK-β蛋白AI對照組7.860±1.5630.411±0.1920.58±0.16低劑量組6.345±1.9900.364±0.0753.80±0.91a中劑量組3.566±1.217ab0.236±0.068ab7.15±0.86ab高劑量組2.776±0.925ab0.172±0.064ab8.82±1.35ab

注：與對照組比較，aP<0.05；與低劑量組比較，bP<0.05

2．各組細(xì)胞凋亡：不同劑量SSd組的AI均顯著增加，且中、高劑量組AI較低劑量組也顯著增加(P值均<0.05，表1)。

討論IKK激酶家族屬于Ser/Thr蛋白激酶超家族成員，主要由IKK-α、IKK-β和IKK-γ 3個亞單位組成，其中IKK-α和IKK-β為功能單位，IKK-γ為調(diào)節(jié)單位，對IKK-α和IKK-β的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)。在靜息狀態(tài)下IKK處于無活性狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到病原微生物、應(yīng)激、細(xì)胞因子、氧自由基等刺激時，引起細(xì)胞內(nèi)一些上游激酶的活化，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)IKK的絲氨酸殘基磷酸化而活化。活化的IKK能使IκB發(fā)生降解，導(dǎo)致NF-κB活化，細(xì)胞抗凋亡能力增加，促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生。Li等[4]通過研究發(fā)現(xiàn)，人胰腺癌細(xì)胞系的IKK-β和NF-κB處于持續(xù)激活狀態(tài)。而Ochiai等[5]利用RNA干擾技術(shù)刪除胰腺癌細(xì)胞IKK-β，此外還應(yīng)用特異性IKK-β抑制劑IMD-0354抑制其活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是基因刪除還是抑制其活性，均能明顯抑制癌細(xì)胞NF-κB活性和增殖，同時促進(jìn)其凋亡反應(yīng)，表明IKK-β可能是治療胰腺癌的一個重要分子靶點。

SSd是從傳統(tǒng)中藥柴胡中分離、提取出來的藥理活性最強的成分之一，具有解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎等藥理作用。近年研究表明，SSd通過直接細(xì)胞毒作用或影響腫瘤細(xì)胞黏附及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等，抑制或殺死人肺癌、胃癌、肝癌、白血病細(xì)胞和小鼠移植性S-180實體瘤等腫瘤細(xì)胞[6-7]，其抗腫瘤的作用引起學(xué)者高度關(guān)注。本研究以IKK-β為靶點，探討了SSd對其在胰腺癌PANC1細(xì)胞表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，中、高劑量組的IKK-β mRNA水平及蛋白表達(dá)均顯著降低，同時三個干預(yù)組的AI值均顯著增高，表明SSd能夠在基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平抑制PANC1細(xì)胞IKK-β表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而且這種作用呈一定劑量依賴性，可能是SSd治療胰腺癌的分子機制。

[1] Li J,Gong LY,Song LB,et al.Oncoprotein Bmi-1 renders apoptotic resistance to glioma cells through activation of the IKK-nuclear factor-kappaB pathway.Am J Pathol,2010,176:699-709.

[2] Bollrath J,Greten FR.IKK/NF-kappaB and STAT3 pathways:central signalling hubs in inflammation-mediated tumour promotion and metastasis.EMBO Rep,2009,10:1314-1319.

[3] Jiang R,Xia Y,Li J,et al.High expression levels of IKKalpha and IKKbeta are necessary for the malignant properties of liver cancer.Int J Cancer,2010,126:1263-1274.

[4] Li L,Aggarwal BB,Shishodia S,et al.Nuclear factor-kappaB and IkappaB kinase are constitutively active in human pancreatic cells, and their down-regulation by curcumin (diferuloylmethane) is associated with the suppression of proliferation and the induction of apoptosis.Cancer,2004,101:2351-2362.

[5] Ochiai T,Saito Y,Saitoh T,et al.Inhibition of IkappaB kinase beta restrains oncogenic proliferation of pancreatic cancer cells.J Med Dent Sci,2008,55:49-59.

[6] 劉振國,陳紅,程延安,等.柴胡皂苷d對大鼠實驗性肝癌形成的預(yù)防作用.西安交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2007,28:643-647.

[7] 王寶峰,程延安,王西京,等.柴胡皂甙D對實驗性大鼠肝癌血管形成的抑制作用.世界華人消化雜志,2008,16:1273-1280.

2010-02-04)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.05.024

300052 天津，天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合外科(吳葆瑩)，急診科(吳崇旭)，普外科(張志翔、劉彤)

吳葆瑩，Email：0e25@sina.com