膜聯(lián)蛋白A1和增殖細(xì)胞核抗原在胰腺癌組織中的表達(dá)及其相互關(guān)系

倪曉光 白曉楓 王貴齊 劉尚梅 郭冰 趙平

·論著·

膜聯(lián)蛋白A1和增殖細(xì)胞核抗原在胰腺癌組織中的表達(dá)及其相互關(guān)系

倪曉光 白曉楓 王貴齊 劉尚梅 郭冰 趙平

目的研究膜聯(lián)蛋白A1(annexin A1，ANXA1)在胰腺癌中的表達(dá)及其與增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的相關(guān)性。方法應(yīng)用組織芯片制作儀構(gòu)建芯片，芯片上有39例正常胰腺組織，42例胰腺癌組織，7例胰島細(xì)胞瘤組織，8例壺腹腺癌組織。在連續(xù)的芯片切片上使用免疫組化法檢測(cè)ANXA1和PCNA蛋白的表達(dá)，分析兩者的相關(guān)性。結(jié)果構(gòu)建的組織芯片在免疫組化染色后的掉片率為11.7%～13.3%，滿足實(shí)驗(yàn)要求。ANXA1在胰腺癌中的陽性表達(dá)率為71.4%(30/42)，明顯高于正常胰腺組織18.4%(7/38)的陽性率(P<0.01)。PCNA在胰腺癌中的陽性表達(dá)率為73.8%(31/42)，也明顯高于正常胰腺組織22.2%(8/36)的陽性率(P<0.01)。胰腺癌組織ANXA1表達(dá)與PCNA表達(dá)顯著相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論胰腺癌ANXA1蛋白的表達(dá)與PCNA表達(dá)同步增加。

胰腺腫瘤； 膜聯(lián)蛋白A1； 增殖細(xì)胞核抗原； 組織芯片

使用基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等高通量技術(shù)手段篩選出一些在胰腺癌與正常胰腺組織之間差異表達(dá)的分子，不僅有助于認(rèn)識(shí)胰腺癌變的分子機(jī)制，更有助于發(fā)掘新的胰腺癌診斷標(biāo)志物及治療靶標(biāo)。膜聯(lián)蛋白A1(annexin A1，ANXA1)是我們前期發(fā)現(xiàn)的一個(gè)在胰腺癌中表達(dá)明顯增強(qiáng)的蛋白質(zhì)[1]，本研究采用免疫組化方法檢測(cè)ANXA1與增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)在胰腺癌中的表達(dá)，探討ANXA1在胰腺癌發(fā)病中的分子機(jī)制。

材料和方法

一、標(biāo)本來源和臨床資料

收集中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院及牡丹江市結(jié)核腫瘤醫(yī)院1990年1月至2002年8月的存檔蠟塊標(biāo)本57例，其中男37例，女20例，年齡19～71歲，中位年齡60歲。將蠟塊標(biāo)本切片，由高年資病理醫(yī)師重新進(jìn)行診斷。最后確診胰腺導(dǎo)管腺癌32例，其中高分化4例，中分化17例，低分化11例；胰腺黏液腺癌6例；胰腺腺泡細(xì)胞癌4例；胰島細(xì)胞瘤7例；壺腹部腺癌8例。所有病例術(shù)前均未接受放、化療。

二、組織芯片的構(gòu)建

根據(jù)HE染色結(jié)果，在對(duì)應(yīng)的供體蠟塊上標(biāo)記出含有所需要的腫瘤或正常胰腺組織(39例)的目標(biāo)區(qū)域，應(yīng)用組織芯片制作儀(Beecher Instruments, Silver Spring, MD)，用直徑0.6 mm的空心細(xì)針從供體蠟塊吸取組織，按預(yù)先設(shè)計(jì)好的排列方式安放在已打好孔的受體蠟塊的適當(dāng)位置。完成排列后，將組織陣列石蠟塊以5 μm厚度連續(xù)切片，貼敷于載玻片，56℃烤片5 h以上。切片做常規(guī)HE染色，驗(yàn)證組織芯片是否與設(shè)計(jì)相符。

三、ANXA1和PCNA蛋白檢測(cè)

采用免疫組化SP染色法，試劑盒購自福建邁新公司。小鼠抗人ANXA1單抗(美國(guó)BD Biosciences Pharmingen)1∶100稀釋，PCNA單抗(中山生物技術(shù)有限公司)1∶150稀釋。以已知陽性組織切片作陽性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。結(jié)果判定[2]：按陽性區(qū)域染色強(qiáng)度評(píng)分，無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分；按陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分，<1%為0分，1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。兩分值相乘，>3分為陽性。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。免疫組化結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有顯著性。

結(jié) 果

一、組織芯片的構(gòu)建

芯片上有39例正常胰腺組織，42例胰腺癌組織，7例胰島細(xì)胞瘤組織，8例壺腹腺癌組織，每例取2～3個(gè)組織點(diǎn)，共排列了256個(gè)點(diǎn)。切片經(jīng)HE染色后，組織學(xué)可觀測(cè)率為95.3%(244/256)。ANXA1免疫組化染色，切片的組織掉片或皺折率為13.3%(34/256)，其中1例正常胰腺和1例壺腹腺癌組織的所有組織點(diǎn)均脫片；PCNA免疫組化染色，切片的組織掉片或皺折率為11.7%(30/256)，其中3例正常胰腺和1例壺腹腺癌組織的所有組織點(diǎn)均脫片。

二、ANXA1和PCNA蛋白表達(dá)

正常胰腺組織中，少數(shù)散在的腺泡和導(dǎo)管細(xì)胞的胞質(zhì)和細(xì)胞核可見ANXA1的表達(dá)(圖1a)，陽性率為18.4%(7/38)。胰腺癌細(xì)胞的胞質(zhì)和細(xì)胞膜可見ANXA1表達(dá)(圖1b)，陽性率為71.4%(30/42)，其中導(dǎo)管腺癌、黏液腺癌、腺泡細(xì)胞癌的ANXA1陽性表達(dá)率分別為75.0%(24/32)、83.3%(5/6)、25.0%(1/4)；胰島細(xì)胞瘤和壺腹腺癌的陽性率均為57.1%(4/7)。各類腫瘤的陽性率均明顯高于正常胰腺組織(P<0.01)，但各類腫瘤間無顯著差異。

正常胰腺組織中，少量腺泡細(xì)胞的細(xì)胞核中有PCNA表達(dá)(圖1c)，陽性率為22.2%(8/36)。胰腺癌細(xì)胞的胞核中有PCNA表達(dá)(圖1d)，陽性率為73.8%(31/42)，其中導(dǎo)管腺癌、黏液腺癌、腺泡細(xì)胞癌的PCNC陽性率分別為81.2%(26/32)、66.7%(4/6)、25.0%(1/4)；胰島細(xì)胞瘤和壺腹腺癌的陽性表達(dá)率分別為42.9%(3/7)和71.4%(5/7)。各類腫瘤的陽性率均顯著高于正常胰腺組織(P<0.01)，但各類腫瘤間無顯著差異。

三、胰腺癌中ANXA1與PCNA表達(dá)的相關(guān)性

在2張連續(xù)的切片上分別行ANXA1和PCNA免疫組化染色(圖2)。42例胰腺癌中，ANXA1與PCNA同時(shí)陽性表達(dá)25例(59.5%)，同時(shí)陰性表達(dá)6例(14.3%)，存在顯著的相關(guān)性(P<0.01)。其中11例低分化胰腺導(dǎo)管腺癌中9例同時(shí)陽性表達(dá)，8例轉(zhuǎn)移性胰腺導(dǎo)管腺癌中6例同時(shí)陽性表達(dá)。

圖1正常胰腺、胰腺癌組織中ANXA1(a、b)和PCNC(c、d)的表達(dá)(免疫組化 ×400)

圖2同一病例連續(xù)胰腺癌組織芯片切片的ANXA1(a)和PCNA(b)的表達(dá) (免疫組化 ×100)

討 論

組織芯片是將數(shù)十、數(shù)百乃至上千個(gè)不同個(gè)體的組織標(biāo)本按預(yù)先設(shè)計(jì)的順序排列在某一載體上而組成的微縮組織切片。使用組織芯片可以在嚴(yán)格、均一的實(shí)驗(yàn)條件下，快速、平行地檢測(cè)大批量組織樣本中的一個(gè)或多個(gè)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，明顯地提高了研究效率，同時(shí)使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具可比性。本文構(gòu)建的胰腺癌組織芯片，免疫組化染色后的掉片率僅11.7%～13.3%，能滿足研究的要求。

Annexins家族是一組結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)，含有高度保守的4或8個(gè)重復(fù)序列組成的C-末端，構(gòu)成其核心結(jié)構(gòu)域，表現(xiàn)出與鈣和磷脂結(jié)合的特性。其N-末端結(jié)構(gòu)域在長(zhǎng)度和序列的差異使Annexins家族成員表現(xiàn)出不同的生物活性，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA

復(fù)制、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、離子通道形成和細(xì)胞凋亡等[3]。ANXA1是其家族中研究比較深入的一個(gè)成員，具有糖皮質(zhì)激素樣作用，參與抑制細(xì)胞增殖、對(duì)抗炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化以及調(diào)節(jié)下丘腦-垂體軸等過程[4]。ANXA1在人惡性腫瘤如鼻咽癌、宮頸癌、前列腺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌和頭頸鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)降低，在結(jié)腸癌、食管和胃交界處的腺癌、腎透明細(xì)胞癌、肺癌、垂體瘤、肝癌、毛細(xì)胞白血病和腦惡性膠質(zhì)瘤中表達(dá)升高，而在乳腺癌中有高表達(dá)和低表達(dá)兩種相反的報(bào)道[5]。本組結(jié)果顯示，ANXA1蛋白在胰腺癌中高表達(dá)。

PCNA是一種在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要功能的核蛋白，在DNA合成的G1期開始增加，S期達(dá)高峰，G2/M期明顯下降[6]。本研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織中PCNA陽性表達(dá)率明顯高于正常胰腺組織，與時(shí)開網(wǎng)等[7]的研究結(jié)果一致。本研究還顯示，胰腺癌組織ANXA1與PCNA的表達(dá)存在明顯的正相關(guān)，尤其在低分化和轉(zhuǎn)移性胰腺導(dǎo)管腺癌中，提示增殖能力強(qiáng)和惡性程度高的胰腺癌細(xì)胞中ANXA1的表達(dá)明顯增強(qiáng)。因此ANXA1可能是促進(jìn)胰腺癌進(jìn)展的一個(gè)重要分子標(biāo)記，值得進(jìn)一步深入研究。

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2009-10-12)

(本文編輯：呂芳萍)

ExpressionofannexinA1andPCNAinpancreaticcancerandtheircorrelation

NIXiao-guang,BAIXiao-feng,WANGGui-qi,LIUShang-mei,GUOBing,ZHAOPing.

DepartmentofEndoscopy,CancerInstitute&Hospital,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100021,China

ZHAOPing,Email:nixiaoguang@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the expressions of the annexin A1 (ANXA1) in pancreatic cancer and the correlations with proliferating cell nuclear antigen (PCNA).MethodsTissue microarray instrument was used to construct the chip. There were 39 samples of normal pancreas tissue, 42 samples of pancreatic cancer, 7 samples of islet cell tumor and 8 samples of ampullary carcinoma. The expressions of ANXA1 and PCNA protein were examined by immunohistochemistry and their correlation was analyzed.ResultsThe off-chip rate of tissue chips after immunohistochemistry was 11.7%～13.3%, which could satisfy the needs for experiment. Immunohistochemical results of pancreatic cancer tissue microarray showed that the positive rate of ANXA1 expression in pancreatic cancer was 71.4% (30/42), which was significantly higher when compared with that of normal pancreas tissue (18.4%, 7/38;P<0.01). The positive rate of PCNA expression in pancreatic cancer was 73.8% (31/42), which was significantly higher than that of normal pancreas tissue (22.2%, 8/36;P<0.01). The expression of ANXA1 had a significant correlation with PCNA in pancreatic cancer (P<0.01).ConclusionsThe expression of ANXA1 protein was significantly increased in pancreatic cancer. The expression of ANXA1 was significantly correlated with the expression of PCNA.

Pancreatic neoplasms; Annexin A1; Proliferating cell nuclear antigen; Tissue microarray

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.05.007

北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(7082057)，北京市科技新星計(jì)劃(2007A105)

100021 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院內(nèi)鏡科(倪曉光、王貴齊)，腹部外科(白曉楓、趙平)，病理科(劉尚梅)；牡丹江市第一人民醫(yī)院頭頸乳腺外科(郭冰)

趙平，Email：nixiaoguang@yahoo.com.cn