甘肅棘豆生物堿抑制小鼠肝癌H22的生長及機理試驗

吳 達,師彥平,張彥明

(1.西北農林科技大學動物醫學院,陜西楊凌712100;2.中國科學院蘭州化學物理研究所,甘肅蘭州730000;3.甘肅出入境檢驗檢疫局,甘肅蘭州730020)

甘肅棘豆(Oxytropis Kansuensis Bunge)是豆科棘豆屬植物,其研究已歷經百年,在積極探討其防除和綜合利用的同時,大量研究結果表明,其生物堿部位具有明顯的抗腫瘤活性[1-3]。本試驗以荷H 22肝癌腫瘤小鼠為模型,進一步研究證實其抗腫瘤活性;并在細胞學水平觀察甘肅棘豆生物堿阻止H 22細胞惡性表型及直接殺傷腫瘤細胞的作用,在分子生物學水平觀察與惡性腫瘤發生發展過程密切相關的增殖細胞核抗原(PCNA)、突變型p53蛋白表達及生物堿的干預作用,為研究甘肅棘豆生物堿抑制腫瘤活性機理提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物及瘤株 動物選用昆明系小鼠,6～8周齡,體重(20±2.0)g,雄性,由甘肅省醫學科學研究院實驗動物中心提供,合格證號：醫動字第14-009號;試驗環境：溫度20℃～22℃,相對濕度45%～50%,環境設施合格證：醫動字第14-019號;H 22瘤株購于中國醫學科學院藥物研究所。按常規方法,無菌條件下,選擇生長良好的H 22,制備成細胞懸液,調整細胞濃度為1.46×106/mL,于小鼠右前腋下接種0.2 mL/只。接種次日,隨機將接種好的小鼠分成3組,每組為10只。抑瘤試驗重復2次。

1.2 藥物 甘肅棘豆生物堿,于中國科學院蘭州化學物理研究所西北天然藥物研發中心提取,參照預試驗及活性篩選給藥量,配制生物堿試驗用劑量為0.25 g/kg,蒸餾水陰性對照組和生物堿試驗組灌胃(ig)給予,接種24 h后開始給藥,給藥量0.2 mL/10 g體重;環磷酰胺(CTX)：中美合資山西泰盛制藥有限公司生產,批號011121,臨時用注射用水配成所需濃度(25 mg/kg),腹腔注射(ip)給藥,每日0.1 mL/10 g體重,給藥10 d。

1.3 試驗用品和試驗方法 所有動物每天給藥1次,連續10 d。并隔日稱體重1次。停藥次日脫頸處死小鼠,剖取瘤塊,稱瘤重及體重,計算抑瘤率。

腫瘤抑制率(%)=(1-給藥組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100%

剖取瘤塊,4℃酸性福爾馬林保存,常規石蠟包埋,切片后行病理檢查(H.E.染色)及PCNA、p53蛋白檢測(免疫組化SP法)。鼠抗PCNA及p53單克隆抗體均購自福州邁新生物技術有限公司。免疫組化SP法,具體操作按說明書進行。

1.4 統計方法 用SPSS軟件包作方差分析。

2 結果

2.1 腫瘤肉眼觀察及抑瘤率 蒸餾水對照組瘤塊相對給藥組和環磷酰胺組較大,腫瘤有液化并和胸膜甚至肋骨粘連,腫瘤血管豐富,不易剝離,呈擴散生長趨勢;生物堿和環磷酰胺組瘤塊較小,腫瘤堅實,顏色蒼白,易于剝離。生物堿給藥組抑瘤率分別為51.89%、39.84%和46.02%,環磷酰胺陽性對照組抑瘤率分別為66.04%、70.31%和75.22%,試驗結果重復性較好,各組與對照組比較差異極顯著(P＜0.001),見表1。

2.2 病理檢查 蒸餾水陰性對照組小鼠腫瘤切片高倍鏡觀察：腫瘤細胞呈團簇狀密集生長,排列堅實,核較大濃染,形態各異,異型性明顯,生物堿給藥組和環磷酰胺組可見大面積紅染無結構的壞死區,腫瘤細胞明顯減少,殘存腫瘤細胞大多萎縮,核深染固縮或碎裂迫向死亡,也可見個別逆轉腫瘤細胞,核明顯縮小,周圍胞漿紅染,核漿比例減小,呈規則的圓形或橢圓形。組織間有炎性細胞浸潤。見中插彩版圖1。

2.3 PCNA表達 PCNA陽性即細胞核染成棕褐色為陽性反應,結果采用PCNA陽性細胞數衡量。隨機觀察10個高倍鏡視野,計算每個高倍鏡視野100個腫瘤細胞中的陽性細胞數,取其平均值作為統計用結果。結果表明,生物堿給藥組和環磷酰胺陽性對照組PCNA陽性表達均較陰性對照減少(見中插彩版圖2)。各組PCNA表達的陽性細胞數見表2,統計學處理差異極顯著(P＜0.001)。

表1 生物堿對小鼠H22腫瘤作用結果

表2 小鼠H22腫瘤細胞PCNA表達

2.4 p53蛋白表達 將所制切片在光學顯微鏡高倍鏡下觀察,以細胞核呈現明顯的棕褐色顆粒狀染色為陽性細胞,細胞核藍染的細胞為蘇木素復染的陰性細胞。免疫組化SP法結果表明,環磷酰胺陽性對照組和甘肅棘豆生物堿組p53陽性細胞數均不同程度低于陰性對照組(P＜0.05),見中插彩版圖3。各組小鼠H 22腫瘤p53表達的陽性細胞數見表3。

表3 小鼠H22腫瘤細胞p53的表達

3 討論

3.1 甘肅棘豆生物堿對小鼠H22腫瘤的抑制作用惡性腫瘤是機體局部組織細胞在各種內部和外界的致癌因子長期作用下,逐漸發生持續性異常增生所形成的新的生長物或新生物,它是由正常細胞獲得了新的生物遺傳特性轉化而來,具有自主性、去分化性和可移植性。惡性腫瘤常導致局部正常組織結構破壞,組織惡性表型,包括細胞異型、細胞核增大、核分裂相、核漿比例增大等[4]。本試驗采用H22腫瘤模型,經病理切片檢查,蒸餾水陰性對照組符合癌變特征,但在給予甘肅棘豆生物堿后,情況有所不同,出現大量腫瘤細胞壞死和惡性表型逆轉,表明其對小鼠H 22腫瘤具有明顯的抑制作用。

3.2 PCNA表達及甘肅棘豆生物堿干預意義PCNA是存在于細胞核內的一種蛋白質,即DNA聚合酶δ的輔助蛋白,與DNA的復制密切相關,它對細胞由G1期向S期過度起著重要的調節作用,與腫瘤細胞的增殖密切相關[5-6]。本試驗蒸餾水陰性對照組腫瘤細胞中的PCNA呈高表達,腫瘤細胞增殖旺盛,而生物堿給藥組PCNA表達降低,說明甘肅棘豆生物堿可抑制H 22腫瘤細胞增殖。

3.3 p53蛋白表達及生物堿干預意義 p53是53kD的核內磷酸蛋白。p53基因突變時,p53蛋白構象發生變化,從而產生積聚并顯示出表達增強,突變型p53在體內有較長的半衰期,免疫組化法可檢測到陽性表達。突變型p53不但喪失抑瘤活性,并可能在DNA復制水平上調節細胞生長,是促進腫瘤發生、發展及導致增殖異常活躍的一個重要因素[7-9]。本試驗中,陰性對照組p53蛋白呈現高表達,生物堿給藥組和環磷酰胺組腫瘤組織p53蛋白呈現較低表達,說明它們能較好防止腫瘤細胞中的p53蛋白成為被激活的突變型p53癌基因,從而減緩腫瘤的生長和惡變。

此外,許多研究認為,在組織惡變過程中p53蛋白與PCNA之間存在著密切的正相關[10-11],作為核內轉入因子的突變型p53基因由于激活了某些細胞增殖相關基因的表達功能,促進細胞增殖,從而使PCNA呈現高表達。本研究在觀察p53蛋白表達的同時也觀察了PCNA的表達,同樣觀察到兩者之間密切而同步的關系。一方面,PCNA與細胞增殖相關,惡性腫瘤重要的生物學特征之一就在于組織細胞自主性增殖、生長;而另一方面,p53基因的突變又與組織細胞惡變有關,因此,在突變型p53基因蛋白表達與PCNA表達的兩者之間存在著前后因果的關系。

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