屠宰豬肝臟中乙型肝炎病毒的PCR檢測與電鏡觀察

劉利強(qiáng),杜 娟,佘銳萍,李文貴

(1.河北工程大學(xué)農(nóng)學(xué)院,河北邯鄲056021;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京海淀100193;3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,云南昆明650201)

HBV為乙型肝炎(hepatitis B,HB)的病原體,是目前已知的最小動物DNA病毒之一。HBV屬嗜肝DNA病毒科,同屬該科的還有土撥鼠肝炎病毒、地松鼠肝炎病毒、鴨乙型肝炎病毒、樹松鼠乙型肝炎病毒等 。HBV 與WHV、GSHV、DHBV的核苷酸同源性分別為70%、55%、40%[1]。這些病毒均具有相似的形態(tài)結(jié)構(gòu),表現(xiàn)為3種顆粒：小球形顆粒、長管形顆粒與有雙層結(jié)構(gòu)內(nèi)含核酸成分的病毒顆粒。這些病毒在生物學(xué)及分子生物學(xué)特性方面也有類似之處,均為雙鏈環(huán)形DNA病毒,但其雙鏈環(huán)形并不完整,其中有長鏈與短鏈之分。已有的研究表明,在家畜和家禽中也存在類乙肝樣病毒群。自20世紀(jì)80年代以來,國內(nèi)有關(guān)豬、雞、牛、羊、犬等動物檢出乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的報道,有的還分離到類乙肝病毒[2-9]。HB嚴(yán)重地威脅著人類的健康,而人類的乙型肝炎的發(fā)病率還在不斷上升。動物,尤其是與人類關(guān)系十分密切的豬體內(nèi)的HBV帶毒情況如何,它們與人的HBV是否具有同源性等等問題,尚不清楚。本研究在已有的基礎(chǔ)上,應(yīng)用PCR技術(shù)和透射電鏡技術(shù),對屠宰豬肝臟的HBV S基因進(jìn)行檢測,利用電鏡觀察乙型肝炎病毒顆粒。

1 材料與方法

1.1 材料 豬肝臟采自北京市某肉聯(lián)廠。

1.2 酶與試劑 Taq酶、dNTP購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司;引物訂自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;NCRquick柱式DNA凝膠回收試劑盒購自新長江生物科技有限公司;pMD18-T載體為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。其他化學(xué)試劑為分析純。

1.3 HBV PCR檢測

1.3.1 核酸提取 取新鮮肝組織標(biāo)本稱重約2 g,加液氮研成粉末,取約20 mg加入DNA提取液(0.5 mmol/LTris-HCl,0.02 mol/L EDTA,10 g/LSDS,0.01 mol/L NaCl,500μg/mL蛋白酶K)42℃～48℃過液,酚/氯仿/異戊醇法提取DNA。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 采用針對HBV S基因保守區(qū)設(shè)計的引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系：10×PCR 緩沖液 2.5μL,引物 HBV-FP、HBV-RP 各0.5 μL,200 μmol/L dNTP 0.5 μL,Taq 0.5 μL(2.5 U),加滅菌水補(bǔ)足至25μL。擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃4 min;94℃30 s,58℃30 s,72℃40 s,30個循環(huán);72℃延伸5 min。10g/L瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈觀察結(jié)果,照相。

表1 檢測屠宰豬肝臟中HBV的引物

1.3.3 PCR產(chǎn)物的克隆和測序 采用NCR quick柱式DNA凝膠回收試劑盒回收擴(kuò)增片段,將其克隆至pMD18-T載體,鑒定后送北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序,用 DNAman(version5.2.2,Lynnon biosoft)分析測序結(jié)果。

1.4 電鏡樣品的制備 肝臟經(jīng)多聚甲醛-戊二醛雙重固定后,修塊,漂洗,1%鋨酸固定,漂洗,經(jīng)30%,50%,70%,80%,90%,95%,100%,100%丙酮各10 min脫水,干燥,包埋,切片,染色,JEM-1230型透射電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測結(jié)果 從屠宰豬肝臟中提取DNA,應(yīng)用HBV S基因區(qū)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物大小約為300 bp,與預(yù)期的281 bp相符(見圖1)。

圖1 屠宰豬肝臟中HBV PCR檢測電泳結(jié)果

2.2 PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果 對擴(kuò)增的片段進(jìn)行測序,結(jié)果發(fā)現(xiàn),所擴(kuò)增區(qū)域與 GenBank中 hbv_25Y07hcc和hbv_26Y08hcc毒株的同源性達(dá)99.05%(見圖2)。

2.3 電鏡觀察 在屠宰豬肝臟樣品的超薄切片中可以看到,在胞核內(nèi)球形病毒樣粒子,散在排列,未見絲狀和管狀體(圖3)。根據(jù)大小不同,這些病毒樣粒子主要可分為2種類型,一種直徑為40 nm左右(圖3圓形箭頭所示),與人類HBV的Dane顆粒相類似;另一種直徑為20 nm左右(圖3箭頭所示),類似于人類HBV的小球狀粒子。

3 討論

目前,國外還未見畜禽體內(nèi)感染 HBV的相關(guān)報道,而關(guān)于動物乙肝病毒的檢測,國內(nèi)已有一些報道,但有關(guān)屠宰豬體內(nèi)乙肝病毒的檢測少有報道。國內(nèi)現(xiàn)有的研究多采用HBV檢測試劑進(jìn)行血清標(biāo)志物和相關(guān)抗原的檢測,也有人對其形態(tài)和S區(qū)基因等進(jìn)行了研究,但對于家畜尤其是豬體內(nèi)的HBV分子病毒學(xué)、與人HBV之間的關(guān)系等的研究還很少。本試驗(yàn)在過去觀察研究的基礎(chǔ)上,應(yīng)用PCR技術(shù)和透射電鏡技術(shù)對屠宰豬肝臟中HBV抗原進(jìn)行了檢測。本試驗(yàn)對編碼HBV最為保守的HBsAg的S區(qū)引物進(jìn)行了擴(kuò)增,從屠宰豬肝臟中檢測出了預(yù)期片段,序列分析結(jié)果表明,與HBV同源性高達(dá)99.05%。丁壯[6-8]等在羊、雞、犬血清中以人乙肝病毒S基因兩側(cè)的保守區(qū)域作為模板,采用套式PCR方法分別擴(kuò)增出羊源、雞源、犬源乙肝病毒S基因,序列分析結(jié)果表明,擴(kuò)增的乙肝病毒與人乙肝病毒在S基因上核苷酸序列有很大的同源性,同源性為98%以上,氨基酸序列同源性為95%以上。李文貴[10]等在豬血清樣品中應(yīng)用HBV S基因區(qū)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,所得產(chǎn)物的序列與GenBank中HBV的同源性達(dá)100%。本試驗(yàn)擴(kuò)增出的目標(biāo)片段序列分析結(jié)果也表明了屠宰豬體內(nèi)HBV與人HBV在S基因區(qū)上具有非常高的同源性。由于本試驗(yàn)所測定序列較短(S基因區(qū)全長約1 185 bp),占S區(qū)基因的23%左右,占HBV全基因組的9%左右,不能進(jìn)行全基因序列比較,但在一定程度上說明了豬HBV與人HBV有較高的同源性。

圖2 屠宰豬肝臟中HBV擴(kuò)增片段與hbv_25Y07hcc和hbv_26Y08hcc株序列的同源性比較

圖3 電鏡下觀察到的豬HBV顆粒

人乙肝患者的肝臟和血清中HBV在電鏡下呈3種形態(tài)的顆粒,其中一種是40 nm的球形顆粒,亦稱為Dane顆粒,是完整的病毒粒子,具有傳染性;另一種是直徑20 nm左右的小球形顆粒被認(rèn)為是病毒增值過程中剩余的產(chǎn)物,不具有傳染性;還有一種長管形顆粒,也無傳染性。本試驗(yàn)中在透射電鏡觀察下發(fā)現(xiàn),在肝臟樣品中存在有形態(tài)、大小與人HBV Dnae顆粒和小球狀顆粒相似的病毒粒子,散在呈小團(tuán)塊狀分布。

現(xiàn)有的研究表明,動物的乙肝病毒對人沒有危害性,不會引起人的疾病,但經(jīng)肉類食品進(jìn)入人體后是否可以引起相應(yīng)的人體的免疫反應(yīng),是否能增強(qiáng)人體內(nèi)的HBV的毒力等等問題現(xiàn)在還不清楚。我國約有10%人為乙肝病毒攜帶者,這么高的感染率是否與豬乙肝病毒存在一定的關(guān)系,值得進(jìn)一步深入研究。

[1] 余傳霖,熊思東.分子免疫學(xué)[M].上海：復(fù)旦大學(xué)出版社,2001：843-871.

[2] 沈柏青,任政華.豬源乙型肝炎病毒樣病毒的提純與鑒定[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),1993(7)：7-9.

[3] 律祥君,侯安祖.黃牛感染人乙型肝炎的研究初報[J].中國人獸共患病雜志,1993,9(4)：34-35.

[4] 李決,王秉清,蔡金環(huán),等.PCR檢測雞類乙型肝炎病毒的研究[J].鄭州牧業(yè)工程高等專科學(xué)校學(xué)報,1994(3)：1-4.

[5] 杜念興,黃吉鳳.從豬和牛檢出類乙肝病毒抗原和抗體[J].畜牧與獸醫(yī),2002,34(1)：3-5.

[6] 丁壯,金寧一.雞源類人乙肝病毒與人乙肝病毒S基因序列分析[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,1999,19(1)：18-21.

[7] 丁壯,金寧一,陳創(chuàng)夫,等.羊源乙肝病毒與人乙肝病毒S基因序列同源性研究[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2001,22(4)：54-58.

[8] 丁壯,王承宇,金寧一,等.犬乙肝病毒 S基因遺傳變異研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2003,25(1)：24-28.

[9] 佘銳萍,李文貴,王英華,等.病毒性肝炎--值得警惕的重要人獸互傳病[J].科技導(dǎo)報,2007,25(4)：44-52.

[10]李文貴,佘銳萍,韋海濤,等.屠宰豬肝和血清中乙型肝炎病毒及戊型肝炎病毒的檢測[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2007,37(11)：921-925.