豬流行性腹瀉的實驗室診斷方法

李思銀，楊亮宇，楊玉艾

（云南農業大學動物科學技術學院，云南 昆明 650201）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種豬的高度接觸性腸道傳染病，病豬以嚴重腹瀉、嘔吐和脫水為主要臨床特征[1]，俗稱冬季拉稀病。本病于1977 年由比利時的Pensaert 首先發現，并從病料中分離出一株不同于豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）的病毒，將其命名為類冠狀病毒（CVL）CV777 株。隨后英國、匈牙利、西德、加拿大、日本等國相繼報道有該病的發生。1982年國際病毒分類委員會將該病毒歸類為冠狀病毒屬。我國于1980 年首次分離得到PEDV，以后許多地區均報道有該病的發生。據有關部門對我國26 個省、市、自治區1987-1989 年疫病普查的不完全統計，在36 種豬病總死亡率中該病的死亡率占1.74%。近年來，該病的流行區域有不斷擴大的趨勢，成為嚴重危害養豬業的傳染病之一。

1 病原學

PEDV 為冠狀病毒科冠狀病毒屬的成員，有囊膜，囊膜上有花瓣狀纖突，長12～24 nm，由核心向四周放射，其間距較大且排列規則，呈皇冠狀。該病毒平均直徑為130 nm（95～190 nm），在外界條件下呈球形，而在糞便中常呈現多種形態。目前發現，該病毒只有一個血清型，不能凝集人、兔、豬、鼠、犬、馬、 羊、牛的紅細胞。該病毒對外界抵抗力弱，對乙醚、氯仿敏感，一般消毒藥可將其殺滅，60 ℃ 30 min，可使其失去感染力，但在4 ℃，pH 5.0～9.0、37 ℃，pH 6.5～7.5 或50 ℃條件下相對穩定。

2 流行病學

該病僅發生于豬，各種年齡的豬均可感染發病，哺乳仔豬、架子豬和育肥豬的發病率可達100%，母豬的發病率在15%～90%，哺乳仔豬尤為嚴重，病死率平均為50%，成年母豬發病率10%～90%。病豬和帶毒豬是主要傳染源，被含有病毒的糞便污染的運輸車輛、飼養員的鞋子或其他帶毒的動物，均可成為本病的傳播媒介，主要通過消化道傳播，也有經呼吸道傳播的報道。PEDV 可在豬群中持續存在，并能在豬體內產生一定的免疫記憶。各種年齡的豬對該病均易感，本病多發生于冬季，12 月份至翌年2月份為本病的高發期，夏季也可發生。PEDV 可單一感染，也可與TGEV 混合感染，但以混合感染較為常見。近年來，臨床上出現了PEDV 與豬圓環病 毒（porcine circovirus，PCV） 混合感染的報道，但發病原因尚不明確。

3 臨床癥狀

PED 常以暴發性腹瀉的形式發生在非免疫斷奶仔豬或各種年齡的豬，主要臨診癥狀與TGE 相似，多表現為水樣腹瀉，糞稀如水，呈灰黃色或灰色，或于進食或吮乳后伴發嘔吐，但程度較輕，傳播稍慢。病豬具體臨床表現因年齡不同而有差異，年齡越小，臨診癥狀越重。1 周齡內新生仔豬常于腹瀉后2～4 d 內因脫水而死亡，病死率可達50%。斷奶豬和肥育豬以及母豬常呈現沉郁和厭食等臨診癥狀，持續腹瀉4～7 d，逐漸恢復正常。成年豬僅表現沉郁、厭食、嘔吐等臨診癥狀，如果沒有繼發其他疾病并護理得當，豬只很少發生死亡。少數病豬出現體溫升高1～2 ℃，精神沉郁，食欲減退或廢絕，尤其是繁殖種豬。

4 病理剖檢

該病的病理剖檢變化主要在小腸，表現為小腸膨脹，充滿淡黃色液體，腸壁變薄，空腸段上皮細胞的空泡形成和表皮脫落。少數病例小腸黏膜有出血點，腸系膜淋巴結水腫，胃內有多量的黃白色凝乳塊，其他實質性器官無明顯病理變化。電鏡觀察可見腸絨毛萎縮，絨毛與腸腺的比率從正常的7 ∶1 降至3 ∶1[2]。

5 診斷

該病的流行病學和臨床癥狀方面與豬傳染性胃腸炎無顯著差別，只是傳播速度比較慢，無法通過臨床癥狀、流行病學和病理變化進行確診，必須借助于實驗室檢查方法才能確診。目前，常用的實驗室檢查方法有病毒的分離鑒定、微量血清中和試驗、免疫電鏡（IEM）、免疫熒光（FAT）、ELISA、RT-PCR 等。

5.1 病毒的分離鑒定

由于細胞培養液中的小牛血清會抑制PEDV 與細胞受體的結合，且胰酶有一定的耐受性，另外原代PEDV 不易在豬腎傳代細胞系（PK-15、IBRS）及非洲綠猴腎（Vero）等細胞上增殖，故該病毒很難培養。1982 年通過胎豬腸上皮細胞單層和胎豬小腸絨毛上皮細胞成功分離得到1 株病毒。近年來又將其適應了Vero 細胞。也有研究表明：用含有60 μg/mL 胰酶液的細胞培養液中進行PEDV 傳代適應，在第3 代就出現明顯的CPE，第5 代毒價可達10-7.0/0.1mL，并通過乳豬回歸試驗和特異性中和試驗證實所增殖的病毒為豬流行性腹瀉病毒[3]。這些病毒分離鑒定的方法對PED血清學、病原學、免疫學等方面的研究提供了一個良好的技術平臺，但由于病毒的分離鑒定需要有一套成熟的細胞培養體系，而且PEDV需要在細胞系中連續傳代才能出現明顯的CPE，目前尚無法推廣應用。

5.2 微量血清中和試驗

林志雄等[4]利用已適應于傳代細胞生長的豬流行性腹瀉病毒PEDV-G1株，以PK-15 作指示細胞，與被檢血清進行微量中和，測定待檢血清中的特異性抗體，48 h 進行結果判定，證實該方法可以用來檢測豬流行性腹瀉病毒，而且檢測結果準確、可靠，具有較高的敏感性，可用于大規模的流行病學調查，并建立了PED 微量血清中和試驗。但該方法需要標準毒株作為指示毒株和成熟的細胞培養體系，實驗條件的限制因素比較多，很難在短期內應用于臨床實踐。

5.3 免疫電鏡法（IEM）

IEM 法可用已知的PEDV 高免血清檢測未知的病毒，又可用已知的PEDV 抗原檢測未知抗體。取經濾過的腸內容物，加等量經過稀釋的高免血清，混合后在37 ℃條件下感作30 min，再移至4 ℃感作18 h，然后將標本在4 ℃以31 000 r/min 離心60 min，沉淀物以少量蒸餾水懸浮后鋪在銅網上，用2%磷鎢酸負染后作電鏡觀察，如可疑病料中含有豬流行性腹瀉病毒粒子，由于抗原和抗體的特異性結合，病毒粒子呈晶格狀排列，并可見到毒粒間的抗體橋。王繼科等[5]把PEDV 的抗原和抗體分別經10 000 r/min 離心、免疫復合物又經12 000r/min 離心后，通過電鏡觀察到了典型的病毒粒子形成的免疫復合物，并建立了具有3 次篩選作用改良的IEM 法。該方法簡便、直觀、快速、定性準確，但該方法要求有價格高昂的電鏡設備，而且電鏡檢查一般需3～7 d 才能出報告，不適用于大規模臨床診斷。

5.4 免疫熒光法

試驗研究證明，用直接免疫熒光法（fluorescent antibody technique，FAT）檢查病料中的豬流行性腹瀉抗原是可靠的特異性診斷方法，目前應用最為廣泛。取病豬小腸作冰凍切片或小腸黏膜抹片，風干后丙酮固定，加熒光抗體染色，充分水洗，封蓋鏡檢，1～2 h 即可得出結果。為了與豬傳染性胃腸炎鑒別，最好同時用豬傳染性胃腸炎熒光抗體染色檢查。崔現蘭等[6]對免疫熒光法用于豬流行性腹瀉的診斷進行了大量的探索，結果表明：FAT 的檢出率為91.4%，間接免疫熒光法（IFAT）的檢出率為89%，而且比電鏡更敏感、更可靠。林志雄等[7]用適應于Vero、PK-15 等傳代細胞株生長繁殖的PEDV-G1 株建立了PEDV 的直接免疫熒光法，并與哈爾濱獸醫研究所的熒光抗體方法檢測結果相比較，陽性符合率達95%（19/20），陰性符合率90%（9/10），且與豬傳染性胃腸炎病毒、豬細小病毒、輪狀病毒和大腸桿菌等沒有交叉反應，證明FAT 法用于豬流行性腹瀉的診斷具有較高的準確性和特異性。由于該方法需要在病死豬只或在腹瀉早期撲殺后取腸道組織制備切片，故很難用于臨床診斷。

5.5 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)

ELISA 試驗可直接應用于糞便中PEDV 的檢測，而且比電鏡更敏感、可靠，應用較為廣泛。當病豬一出現腹瀉，即可進行檢測，甚至痊愈不久的病豬，仍可用該方法進行檢測。陳茹等[8]用分離純化的PEDV 抗原，建立了用于檢測PEDV 抗體的斑點酶聯免疫吸附試驗（Dot-ELISA），并對比了該方法和瓊脂擴散試驗的檢測情況，結果表明，Dot-ELISA 更敏感，且該法重復性較好。鄒勇等[9]用PEDV 細胞培養物提純的抗原，組織毒免疫獲得的高免血清建立了間接ELISA 檢測PEDV 抗體水平。結果表明：包被抗原濃度為1 ∶20000，酶標羊抗豬IgG濃度選用1 ∶250 為測定抗PEDV IgG抗體的最適工作濃度。田間檢測結果與臨床發病和預期結果一致。韓國學者Kim O 等[10]建立了可在福爾馬林固定、石蠟包埋的腸組織中準確而特異的檢出PEDV 的單克隆抗體基礎上的免疫組化法，該方法也可用于鑒別診斷PEDV 與TGEV。但該方法對病料的前期處理比較繁瑣。

5.6 反轉錄—聚合酶鏈式反應（RTPCR 法）

近年來，隨著分子生物學的發展，對于PEDV 和TGEV 核酸的檢測方法越來越受到人們的重視。有研究表明，RT-PCR 法是目前鑒別診斷TGEV 和PEDV 最敏感、特異的方法。傳統方法診斷主要從病毒的分離與鑒定、抗原檢測、電鏡檢測、血清學診斷等方面進行。與傳統方法比較，RT-PCR 方法只需要病豬的糞便即可進行活體診斷，便于疾病的早期診斷，敏感性和特異性高，而且操作步驟更加快速、方便，一般4～6 h 內可以提供準確的結果。

Ishikawa K 等[11]根據S基因序列設計了1 對引物，成功建立了可用于檢測細胞和糞便中PEDV的RT-PCR 法，此法靈敏度可達100 TCID50/mL，并可在8 h 內得出檢測結果。Kubota 等[12]在N 基因的基礎上，也成功建立了可進行PEDV細胞毒和糞便毒的RT-PCR 檢測方法。Kim O 等[13-14]已建立了TGEV和PEDV 的 二 聯RT-PCR 診斷方法，并對免疫組化、原位雜交、RTPCR 3 種方法進行了比較，結果表明RT-PCR 法檢測結果的重復性最好，但當被檢樣品為福爾馬林固定時，更適宜采用免疫組化和原位雜交法。

吳凌等[15]將豬流行性腹瀉病毒分離株HLJ02，經過胰酶處理后，在Vero 細胞上增殖， 用RT-PCR 和RT-nested PCR 分別擴增出854 bp的M 全基因片段和412 bp 的M 基因部分片段，而豬傳染性胃腸炎病毒和Vero 細胞培養液中未擴增出上述產物，表明RT-nested PCR 可用于檢測豬流行性腹瀉病毒。劉鄧等對TGEV和PEDV 的二聯RT-PCR 檢測方法進行了改進，提高了病毒感染初期的敏感性，并建立了用于檢測PEDV 的TaqMan 熒光定量RT-PCR 法，對TaqMan 熒光定量RT-PCR 法和RT-PCR 法的檢測結果進行了對比和分析，結果表明普通RT-PCR 檢測PEDV 存在漏檢的可能，而TaqMan熒光定量RT-PCR 法具有準確、定量、污染低、靈敏度高、特異性強及省時省力等優點[16，17]。但該方法對實驗操作人員以及實驗條件等的要求較為嚴格，以及檢測成本的限制，因此在推廣上仍有很大的限制。

PED 與TGE 的臨床癥狀極其相似，所以診斷非常困難。最初的實驗室診斷主要依靠傳統的病毒分離與鑒定、中和試驗、免疫電鏡、免疫熒光等病原學診斷方法，這些方法都能對PED做出準確的診斷，但是一般都只能在病豬死亡后或者早期撲殺后才能進行，而且檢測前病料的前期處理比較繁瑣，有的甚至要求價格高昂的實驗設備或成熟的細胞培養體系，操作復雜而且耗時。隨著分子生物學的發展，RTPCR 技術被應用到PEDV 診斷技術中，雖然此法敏感性和特異性都很好，但由于需要特殊的儀器設備，目前只適用于實驗室診斷，不適用于臨床診斷。綜合考慮，直接免疫熒光法（FAT）和ELISA 相對比較方便，而且準確性比較高，目前應用最為廣泛。

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