豬流行性腹瀉疫苗的研究

陳建飛，馮 力，時洪艷，崔尚金

（中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室、豬傳染病研究室，黑龍江 哈爾濱 150001）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由尼多目（Nidovirales）、冠狀病毒科（Coronaviridae）、冠狀病毒屬（Coronavirus）α-冠狀病毒中的豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic d iarrhea virus，PEDV）引起的豬的一種急性、高度傳染性的腸道疾病，該病以急性腸炎、嘔吐、水樣腹瀉和脫水為主要特征。各種日齡的豬均易感，尤其是哺育仔豬，發病率高達100%，死亡率為30%～80%。

PED 于1971 年首次在英格蘭的架子豬和育肥豬群中暴發；1978 年在比利時和英國流行性腹瀉發作期間，該病被證實是由PEDV 引起的[1]。到目前為止，歐洲和亞洲的許多養豬國家都有該病的報道[2]，而北美和南美至今還未見該病的報道。1973 年，類豬傳染性胃腸炎的急性腹瀉首先在我國上海發生，但是直到1984 年，才經熒光抗體試驗和血清中和試驗證實該病的病原是PEDV[3]。到目前為止，我國已有24 個省報道了PED 的發生和流行情況。PED 主要發生在冬春季節，病毒主要通過感染豬的糞便而傳播，自然感染病例大多是經口攝入而感染，糞——口途徑是該病的主要傳播途徑。隨著集約化養殖規模的不斷擴大，給該病的傳播創造了有利條件。目前，疫苗接種是預防和控制該病的有效手段。現結合本課題組的研究進展及國內外的相關研究進展，回顧總結一下PED 疫苗的研究情況。

1 PED組織滅活苗

1993 年本課題組的王明研究員等[4]將經接種仔豬、免疫熒光檢查及與PED CV777 毒株對比試驗證實為PEDV 的滬毒株（S 株）接種3～9 日齡仔豬，待典型發病后迫殺，采集小腸組織及內容物，制備PED 氫氧化鋁滅活苗，填補了國內外無PED疫苗的空白。該疫苗經后海穴注射，對仔豬的主動保護率為85%，被動保護率為97.06%。接種后2 周開始產生免疫力，免疫期可達6 個月。

2 PED細胞滅活苗

由于組織滅活苗存在操作繁瑣、生產成本高及質量難以控制等缺點，本課題組馬思奇研究員等[5]采用在病毒培養液中加適量胰酶的培養方法，將PEDV CV777 適應于Vero 細胞，以28代毒制備氫氧化鋁滅活苗，后海穴接種，對仔豬的主動免疫保護率為85.19%，被動免疫保護率為85%。通過該方法制備的PED 細胞滅活苗可用于現地PEDV 的預防與控制。

3 PED弱毒苗

雖然滅活疫苗具有安全、穩定的優點，但同時由于滅活疫苗具有需要大劑量接種或者應用濃縮抗原；免疫期短，常需強化接種；不能引起局部免疫，以致細胞免疫的作用弱；產生完全免疫力需要2 周；不利于緊急預防接種與降低疫苗費用等缺點，促進了PED 弱毒疫苗的研制。目前，PED 的商品化弱毒疫苗主要有我國的CV777 株，日本的P-5V 株和韓國的KPED-9 株、DR13株。本課題組的佟有恩研究員等[6]將適應Vero 細胞的CV777 株從90 代起進行克隆純化，目的是穩定減弱的毒力并保持良好的免疫原性。克隆后的弱毒株仍保持良好的安全性，主動免疫與被動免疫的保護率分別達到95.92%及96.2%。穩定性試驗經6 代次的返祖傳代仍是穩定的，未見毒力返強，證明此弱毒株已培育成功，符合弱毒疫苗毒株的條件。日本的P-5V 株雖然沒有連續傳代致弱的相關報道，卻在日本和韓國用于PED 的預防。韓國的KPED-9 是由從新生仔豬分離的KPEDV-9 通過Vero 細胞連續傳代93 代后制備而成的；DR13 是由從患病仔豬小腸內容物分離的DR13 強毒通過Vero 細胞連續傳代而成，該疫苗是韓國用于預防PED 的口服疫苗。

3 轉基因植物疫苗

在病毒性腹瀉的免疫機制中，黏膜免疫具有非常重要的作用。腸道黏膜分泌的IgA 抗體能抵御入侵的病原體。口服疫苗能刺激黏膜免疫，并能產生黏膜和血清保護性IgA 抗體，是預防腸道傳染病的有效途徑。轉基因植物作為口服疫苗有可能產生理想的黏膜免疫反應，從而達到預防病毒性腹瀉病的目的。2003 年，韓國Bae 等將PEDV 中和表位區域COE 基因轉入到煙草，構建了表達抗原的轉基因煙草。利用表達的抗原口服免疫小鼠，試驗結果表明能有效地誘導產生保護宿主細胞免受PEDV 感染的體液和黏膜免疫應答。盡管在煙草中表達的PEDV 表位有抗原決定簇，但是外源抗原在煙草中表達水平低限制了轉基因植物疫苗的發展，為此，2005 年，Kang 等在無尼古丁的煙草中表達了合成的PEDV 中和表位基因，外源抗原的表達量占全部可溶性植物蛋白的2.1%,大約是天然基因表達量的五倍，為可食轉基因植物疫苗的研究奠定了基礎。

4 乳酸桿菌疫苗

乳酸桿菌作為微生態制劑中的主要益生菌，廣泛應用于食品、飼料加工業。構建乳酸桿菌質粒載體，表達在黏膜系統中增殖的病原微生物的保護性抗原基因，制備綠色環保、可食用的多功能黏膜免疫的微生態制劑疫苗應用前景廣闊。而黏膜免疫恰恰是防治TGE 和PED 的主要途徑。葛俊偉等[7，8]先后構建了表達PEDV N 基因和中和抗原位點的重組干酪乳桿菌，并將表達的外源蛋白口服免疫小鼠；研究結果表明表達PEDV N 蛋白的重組干酪乳桿菌和PEDV COE 蛋白的重組干酪乳桿菌具有良好的免疫原性，可以刺激腸道產生局部免疫應答，又可誘導產生系統特異性免疫應答，經口免疫小鼠能激發出特異性的體液免疫和細胞免疫；在小鼠體內顯示了很好的免疫效力,為口服疫苗的研制奠定了基礎。

5 二聯苗

目前，在我國用于PED 預防和控制的疫苗主要是PED-TGE 二聯苗。由于PEDV 和TGEV 均屬于冠狀病毒，而且致病機理相似，組織嗜性相同。因此，研制聯苗亦是可行的。本課題組先后研制成功PED-TGE 二聯滅活疫苗和PED-TGE 二聯弱毒疫苗[9，10]。該二聯疫苗的特點是：毒價高，后海穴接種（是對常規免疫途徑的突破），增強了免疫保護力，一次接種即可，省時、省力。經國內外聯機檢索查新證明，該二聯苗是國際領先研制成功的，并在技術上有原始創新。2 種疫苗主要用于妊娠母豬的，以被動免疫保護仔豬，也用于主動免疫保護不同日齡的豬只。其中二聯滅活苗主動免疫保護率為96%，被動免疫保護率為85.1%；二聯活疫苗主動免疫保護率為97.7%，被動免疫保護率為98%。2 種二聯疫苗的免疫期為6 個月，仔豬被動免疫期是哺乳期至斷奶后1 周。滅活疫苗在免疫后14 d 產生免疫力；二聯活疫苗免疫后7 d 產生堅強的保護。

6 展望

豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬輪狀病毒是引起豬病毒性腹瀉的主要病原，而且在現地豬群中常常混合感染，給我國養豬業帶來了很大的經濟損失。因此，開發研制預防3 種疾病的聯苗是切實可行的。本課題組馮力研究員等先后研制了“豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉與豬輪狀病毒三聯滅活疫苗”和“豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉與豬輪狀病毒三聯活疫苗”。目前，三聯活疫苗在4個省的9 個豬場先后進行了不同批次疫苗的臨床試驗（共計45 000 頭份）。臨床試驗各豬場反饋效果良好，區域免疫保護率超過95%，豬場病毒性腹瀉發病率由原來的8%～12%下降到3%～5%，為各豬場減少了損失，提高了經濟效益。這表明我們研制的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒三聯活疫苗在預防仔豬病毒性腹瀉方面效果甚佳，無副作用，是一種安全有效的疫苗，值得大規模生產，擴大使用區域的范圍，加以推廣。

[1] Pensaert MB, de Bouck P (1978)A new coronavirus-like particles associated with diarrhea in swine.Arch Virol. 58:243-247．

[2] Pensaert M B，Yeo S G (2006)Porcine epidemic diarrhea. In: Straw B E, Zimmerman JJ, D’Allaire S,Taylor D J (ed) Disease of Swine,9th edn. Blackwell Publishing, Ames,IA, pp 367-372

[3] 宣華，邢德坤，王殿瀛，等．應用豬胎腸單層細胞培養豬流行性腹瀉病毒的研究[J]．中國人民解放軍獸醫大學學報，1984，4（3）：202-208．

[4] 王明，馬思奇，周金法，等.豬流行性腹瀉滅活疫苗的研究[J].中國畜禽傳染病,1993,5:17-19.

[5] 馬思奇，王明，周金法，馮力.豬流行性腹瀉病毒適應Vero 細胞培養及以傳代細胞毒制備氫氧化鋁滅活苗免疫效力試驗.中國畜禽傳染病,1994（2）:15-19．

[6] 佟有恩，馮力，李偉杰．豬流行性腹瀉弱毒株的培育.中國畜禽傳染病，1998，20（6）：329-332．

[7] 葛俊偉，姜艷平，汪淼．表面表達豬流行性腹瀉病毒核蛋白蛋白的重組干酪乳桿菌誘導產生的免疫應答．生物工程學報，2009,25（6）：813-818．

[8] 葛俊偉，姜艷平，汪淼．表達豬流行性腹瀉病毒中和抗原位點的重組干酪乳桿菌免疫小鼠誘導的免疫應答．中國獸醫科學，2010，40（7）:708-712．

[9] 馬思奇，王明，馮力．豬傳染性胃腸炎與豬流行性腹瀉二聯氫氧化鋁滅活疫苗的研究．中國畜禽傳染病，1995，17（6）：23-27．

[10] 佟有恩，馮力，李偉杰．豬傳染性胃腸炎與豬流行性腹瀉二聯弱毒疫苗的研究．中國預防獸醫學報，1999，21（6）：406-410．