桔青霉發酵制備核酸酶P1研究進展

喻 晨，趙 劼，張亞雄，朱昌雄，姚 鵑，李知洪

（1.三峽大學生物工程重點實驗室，湖北宜昌443002；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443003）

桔青霉發酵制備核酸酶P1研究進展

喻 晨1，趙 劼2，張亞雄1，朱昌雄2，姚 鵑2，李知洪2

（1.三峽大學生物工程重點實驗室，湖北宜昌443002；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443003）

核酸酶P1是一種重要的工業酶制劑，可用于水解核酸生產5’-核苷酸。本文綜述了利用桔青霉發酵得到核酸酶P1的菌種選育、培養基優化、發酵工藝控制、濃縮、相關應用和國內外市場狀況。

核酸酶P1，桔青霉，發酵法

核酸酶P1（Nuclease P1），又名5′-磷酸二酯酶，其作用為水解核酸中的3′，5′-磷酸二酯鍵得到四種5′-核苷酸。核苷酸是生物體內重要的低分子化合物，具有許多生理功能，目前，隨著在嬰幼兒奶粉及保健品領域的廣泛應用，核苷酸市場變得越來越大。核酸酶P1在核苷酸工業化生產中起著至關重要的作用。從目前的研究和工業化現狀來看，核酸酶P1主要通過桔青霉（Penicillium citrinum）發酵和麥芽根提取［1］兩種途徑生產，但由于麥芽根中可能含有的N-甲基大麥芽堿、亞硝胺、展青霉毒素、米曲霉毒素和蕁麻青霉菌毒素等物質對人體有害，同時麥芽根提取酶活水平較低，原酶液酶活為300U/mL［2］，而且受麥芽根本身品質影響較大，目前，麥芽根提取核酸酶P1技術在工業化生產中沒有任何優勢；桔青霉發酵生產核酸酶越來越受到酶制劑工業的重視，此外，研究表明桔青霉產生的核酸酶P1在酵母抽提物生產中參與酵母產品風味的提高，對操作工人和消費者是安全的［3］。目前，有關桔青霉發酵產核酸酶P1的研究主要集中在以下幾個方面。

1 核酸酶P1性質研究

核酸酶P1的分子量約為24000，由331個氨基酸多肽單鏈構成，含有2個二硫鍵，并含有3個鋅原子，酶分子含17.4%的碳水化合物（圖1）。

圖1 核酸酶P1結構［4］

核酸酶P1的溫度適用范圍比較廣，是一種熱穩定酶，在45～95℃均有催化活性。其最適酶反應溫度為70℃［5］。最適pH因底物而異，一般在pH5～8都有較強的活性。核酸酶P1的最適pH還與溶液中的離子種類和離子強度有關。對于酵母核酸而言，此酶的最合適pH為5.0左右。郭春香［5］等人研究了金屬離子對核酸酶P1催化活性的影響，其結果表明Ti3+、Ce3+在濃度大于 10-3mol/L時，Mn2+、Fe2+、Co2+、Cu2+和Pd2+在濃度10-3～10-5mol/L的范圍時均表現出明顯抑制作用。Mg2+和Ca2+對酶活略有促進的效果［6］（見圖2）。

Zn2+在10-2～10-6mol/L的濃度范圍對該酶的酶活有激活作用，這與核酸酶P1的結構（見圖1）有關，研究表明，核酸酶P1分子結構中含有3個鋅原子，各個鋅原子作用如下［7］：鋅I主要參與維持酶的三級結構從而確保酶與大分子底物如RNA的結合。鋅II用于活性構象的維護。通過圓二色譜在遠紫外區檢測發現，鋅I和鋅II并不參與維護二級結構，鋅III主要起維持完整二級結構的決定性作用。

核酸酶P1在部分有機溶劑中，如甲基酰氨、二甲亞砜存在時仍有較高的酶活，在低濃度的變性劑環境中酶活有一定提高。B.N.Gangadhara［8］等人研究核酸酶 P1在低濃度的尿素（1mol/L）和鹽酸胍（0.5mol/L）條件下酶的活性可以提高3～4倍（見圖3）。

圖2 不同金屬離子對核酸酶活性的影響［5］

圖3 有機溶劑濃度對核酸酶P1活性的影響［7］

2 核酸酶P1的發酵研究

目前利用桔青霉發酵法生產核酸酶P1的研究主要集中在高產菌株選育、發酵工藝優化和酶的分離純化濃縮工藝等三個領域。

2.1 菌種選育研究

桔青霉菌種誘變主要采用物理和化學方法，通過物理和化學手段對生物體DNA產生影響，使其發生變異，得到高產突變菌株。洪亦武［9］等人分別對桔青霉菌種（AS3.2788和AS3.2833）采用紫外線、硫酸二乙酯、亞硝基胍作為誘變劑誘變，發現亞硝基胍和紫外線作誘變劑效果較好，二者復合誘變效果更佳，采用0.5mg/mL的亞硝基胍處理60min，再經紫外線處理60s，對出發菌株的致死率達到90%，篩選得到了3株高產菌株，酶活達到345U/mL。李科德等人［10］以桔青霉菌株（ATCC14994）為出發菌株，也采用紫外線與亞硝基胍相結合的方法多次誘變育種，獲得1株高產菌株，酶活達到1329U/mL。

此外，一些新的誘變方式也有報道，蘇龍［11］等人對桔青霉進行微波誘變得到1株核酸酶高產菌株，采用脈沖頻率為2450MHz，功率800W的微波爐，分別對相同濃度和體積的單孢子懸液進行輻射處理，使誘變菌株產酶水平由 667.50U/mL提高到1228.20U/mL，提高了84%。

離子束注入技術是20世紀80年代初材料學中興起的一項高新技術，近幾年逐漸引入到微生物育種［12］。吳永宏［13］采用氮離子束注入對桔青霉 M02進行誘變，確定最佳注入能量為20keV，最佳注入劑量20×1014N+·cm-2，篩選出5株正突變株，發酵酶活比出發菌種提高了61%。南京工業大學應漢杰等人也通過離子束注入對桔青霉菌種進行誘變研究，控制離子注入室的真空度2×10-2～2×10-8，注入能量為0.1～1000keV，劑量為5×1013～500×1013ions· cm-2·s-1，低能離子為N+、Ar+、O6+或C6+，最終獲得了高產核酸酶P1的桔青霉菌株（CGMCC No.2014），采用三級放大發酵培養，發酵終點酶活達到5800U/mL［14］，這也是目前已有報道中見到的最高產酶菌株。

2.2 發酵工藝研究

從已有文獻來看，目前利用桔青霉發酵生產核酸酶P1的方式主要有液體深層發酵，固態發酵和固定化細胞培養的方法。

2.2.1 固態發酵法 微生物在具有一定溫度和濕度的固體培養基的表面生長、繁殖、代謝的發酵過程稱作為固態發酵。以麩皮為培養基培養桔青霉，操作簡單，成本低，能得到較高酶活的粗酶液。蘇慶輝［1］利用麩皮固態發酵法生產核酸酶P1，酶活可以達到500U/mL。但是，由于發酵周期長，占用空間大，且發酵過程中孢子污染環境，同時由于麩皮成分非常復雜，要想獲得純的核酸酶P1較為困難和繁瑣。因而，該生產工藝基本沒有被生產廠家采用。

2.2.2 液體深層發酵法 液體深層發酵主要研究培養基優化和發酵工藝控制策略。李科德［2］等人對高產核酸酶P1的桔青霉進行了培養基中碳源、氮源、磷源成分篩選，確定了以蔗糖為碳源、酵母膏和蛋白胨為復合氮源、KH2PO4和K2HPO4為復合磷源的培養基。并通過正交實驗得出對酶活的影響順序為蔗糖＞酵母膏+蛋白胨＞MgSO4+ZnSO4＞KH2PO4+ K2HPO4。徐正軍［15］采用中心組合設計對碳源、氮源、磷源進行優化以最大限度地提高核酸酶P1的發酵水平，結果表明，最優的碳、氮源組成為葡萄糖3.87%、蛋白胨0.191%、玉米漿0.184%，此時的核酸酶P1的產酶水平最高，模型預測值可以達到661.1U/mL，驗證實驗酶活達到648.3U/mL，比優化前提高了70%。此外，金屬離子對桔青霉菌體產酶也有顯著影響，其中，Zn2+對酶活影響較大［16］，研究表明0.04%鋅離子濃度對于核酸酶P1的生成和激活有重要作用。婁永江等人［17］對發酵培養基中的金屬離子種類進行了研究，得出低濃度的Zn2+能使酶活提高20%左右，Fe2+、Sn2+也能小幅提高酶活，在高濃度的 Fe3+、Mn2+、Pb2+下酶活被抑制，Ca2+、Mg2+、 Na+、K+、對菌體產酶影響不大。

梁劍光［18-19］等對桔青霉發酵的工藝條件進行了相關研究，結果表明，種齡24h，接種量10%，初始pH6.5條件下，較高的發酵溫度下產酶最高點明顯提前，而在較低溫度下，發酵周期延長，但有利于菌體產酶。王端好等人［20］研究了溶氧對桔青霉發酵產核酸酶的影響，發現搖瓶裝液量為20%時，搖床轉速為180r/min，產酶最好，表明菌體產酶需要較高的溶氧。徐正軍［21］等人利用30L氣升式發酵罐研究了桔青霉產酶的發酵動力學，結果表明，核酸酶P1是不完全伴隨菌體生物量生長的產出產物，屬于部分耦聯，其發酵過程屬于部分耦聯型發酵（圖4）。

圖4 桔青霉發酵過程中產酶與生物量的關系［21］

此外，梁劍光等在研究中也發現，核酸酶P1的產酶量和菌體的生長關系不大，但是卻與菌體的生長速率有著一定的相關性，當菌體處于快速生長期時，其產酶也相應進入快速期［19］。

2.2.3 固定化菌體培養 固定化微生物技術是指用物理或化學方法將游離微生物細胞、動植物細胞、細胞器或酶限制或定位在某一特定空間范圍內，保留其固有的催化活性，并能被重復和連續使用的技術［22］。其優點在于培養生物密度高、反應迅速、生物流失量少、反應控制容易［23］。固定化細胞技術的關鍵是所用載體材料的性能［24］。夏黎明［25］利用吸附固定在多孔聚酯載體上的桔青霉菌絲生產核酸酶，酶活可高達513.3U/mL，其產酶效率是游離菌絲的3.6倍，而葡萄糖和蛋白陳的用量僅為游離菌絲產酶的1/5，連續生產28批（56d），產酶水平沒有下降，平均酶活達到507U/mL。煙臺大學王克明［26］等人通過使用雙載體固定化桔青霉產核酸酶，先使用玉米芯顆粒吸附桔青霉孢子，再用質量分數為1.5%的海藻酸鈉包埋吸附固定化細胞玉米芯顆粒，培養50h后，發酵液中核酸P1的活力高達503U/mL。河南工業大學宋威［27］等人采用復合載體固定化細胞的方法，研究不同的材料和材料間不同配比對酶活力的影響，最終得出聚乙烯醇與海藻酸鈉比例為2∶1的復合載體固定桔青霉的孢子，連續發酵20個周期后，生產的核酸酶P1酶活力損失不大，始終保持在468.3～501.4U/mL。

復合載體作為一種新的固定化載體，突顯出機械強度大，使用壽命長等優點。同時固定化細胞培養方式解決了液體深層發酵成本高的問題，重復利用率高，具有很好的工業應用價值。

2.3 酶的分離純化與濃縮工藝研究

呂浩［28］等人將桔青霉發酵液通過硫酸銨分級沉淀、凝膠層析和離子交換纖維素層析等生化分離步驟，核酸酶 P1的比活力為711U/mg，純化倍數為1500。廖紅東［29］對桔青霉發酵液經離心、超濾、硫酸銨鹽析、透析和DE-52型樹脂柱色譜分離，純化得到核酸酶P1，比酶活為28490U/mg，純化10.5倍。張一平［30］等采用超濾和鹽析技術，對麥芽根浸提液中核酸酶P1進行純化，酶活比初始提高了15倍，達到1500U/mL，其研究創新地將超濾和鹽析技術相結合，對桔青霉發酵中核酸酶P1的純化濃縮有指導意義。

3 核酸酶應用研究

目前，核酸酶P1主要是用于酵母核酸水解，一般最適反應溫度在70℃左右，pH6.5，水解時間4～5h。鄧義熹［2］等人研究得出，在3%底物濃度下，加入5%的用酶量，反應2h時補加核酸底物，可以提高酶的利用率，酶解率維持在85%以上。而酶解反應中隨著產物的增加，酶促反應速率也相應地受到影響。楊大令［31］等人在制備5′-核苷酸設備研究中采用了新型的分體式中空纖維酶膜反應器。其優點在于反應中形成產物可透過膜分離出來，酶則繼續參與反應循環往復，從而提高酶解率，通過優化，當核酸底物濃度為2%時，核酸酶P1濃度為100mg/L，pH為5.2，溫度為65℃，過膜壓力為0.1MPa，反應5h酶解率可達85%。

此外還可以通過固定化酶技術來提高酶水解率，邵衛祥［32］等人采用磁性納米顆粒與酶蛋白共沉淀后經戊二醛交聯的方法，制備了磁性交聯核酸酶P1聚集體，結果表明：磁性交聯核酸酶P1聚集體在熱穩定性，耐酸堿性均優于游離酶，重復操作性穩定，游離酶和磁性交聯核酸酶P1聚集體的Km值分別為7.27、30.7mmol/L，最適反應溫度分別為75、90℃，最適 pH均為 5.2，連續使用 6次酶解率仍有70%。

4 展望

隨著我國核酸工業化的不斷推進，核酸酶P1在核苷酸工業生產中起到的重要作用，使核酸酶P1的需求量也越來越大。而我國國內核酸酶P1生產廠家不多，造成核酸酶P1供應緊缺，目前市場來源主要依靠國外進口。由此可見，該酶市場前景巨大。我國核酸酶P1的開發和生產以及相關應用研究還須進一步加深。

［1］蘇慶輝，馬興勝，袁艷玲，等.5′-磷酸二酯酶的提取［J］.釀酒，2004，31（1）：88-90.

［2］鄧義熹，趙劼，張亞雄，等.麥芽根提取5′-磷酸二酯酶對RNA酶解工藝研究［J］.食品工業科技，2010（1）：207-209.

［3］Mitsuru Kondo，Susumu Nishimura，Noriho Tanaka，et al. Safety Evaluation of Phosphodiesterase Produced from Penicillium citrinum Summary of Toxicological Data［J］.Regulatory Toxicology and Pharmacology，2001，33：2-11.

［4］A Volbeda，A Lahm，F Sakiyama，et al.Crystal structure of Penicillium citrinum P1 nuclease at 2.8 A resolution［J］.The EMBO Journal，1991，10（7）：1607-1618.

［5］郭春香，邵昌平，郭和夫.金屬離子對核酸酶P1催化水解RNA反應的影響及其機理探討［J］.催化學報，1992，13（4）：316-319.

［6］Guo-Qing Ying，Shi Lu-E，Yiyu，et al.Production，purification and characterization of nuclease P1 from Penicillium citrinum［J］.Process Biochemistry，2006，41：1276-1281.

［7］Kyuji Rokuguawa，Masao Fujimoto，Akira Kuninaka，et al. The Role of Zinc in NucleaseP1［J］.Agric Biol Chem，1980，44：1987-1988.

［8］ Gangadhara B N，KumarParigiRamesh，Prakash Vishweshwaraiah.Enhancement of nuclease P1 activity in low concentration ofdenaturants［J］.Enzyme and Microbial Technology，2008，43：336-342.

［9］洪亦武，曹郁生，黃燕方，等.核酸酶P1產生菌的誘變選育［J］.江西科學，1995，13（4）：224-228.

［10］李科德，韓木蘭，柏建玲，等.5′-磷酸二酯酶高產菌株的選育和發酵培養條件的優化［J］.微生物學雜志，2001，21（3）：28-30.

［11］蘇龍，陳顯玲.微波誘變選育核酸酶P1高產菌株［J］.中國釀造，2008（5）：62-63.

［12］陳義光，李銘剛，徐麗華，等.新型物理誘變方法及其在微生物誘變育種中的應用進展［J］.長江大學學報：自科版，2005（5）：46-68.

［13］吳永宏.酶法水解DNA制備5′-脫氧核甘酸的研究［D］.南京工業大學，2005.

［14］應漢杰，楊蘊毅，賀沁婷，等.一株高產核酸酶P1的桔青霉菌及其選育方法［P］.200710022932，2007-11-07.

［15］徐正軍，肖林平，呂浩，等.實驗設計法優化核酸酶P1的發酵培養基［J］.過程工程學報，2003，3（5）：433-437.

［16］陳珊珊，曹劍紅.Zn2+對5′-磷酸二酯酶活性的影響［J］.福建醫藥雜志，1994，16（3）：49.

［17］婁永江，吳漢民，王海洪.從桔青霉M71生產核酸酶P1及酶活提高途徑的研究［J］.寧波大學學報，1997，20（3）：21-27.

［18］梁劍光，黃鵬，徐正軍.桔青霉發酵法生產核酸酶P1工藝條件及影響因素研究［J］.中國釀造，2007（11）：27-30.

［19］梁劍光，黃鵬，徐正軍.呈味酶制劑-核酸酶P1發酵生產工藝初試［J］.中國調味品，2007（6）：70-73.

［20］王端好，周河治，張小里.桔青霉生產核酸酶的發酵條件研究［J］.生物加工過程，2008，6（2）：33-37.

［21］徐正軍，呂浩，何明芳，等.氣升式發酵罐生產核酸酶P1發酵過程的動力學［J］.南京工業大學學報，2004，26（2）：28-32.

［22］夏冰，趙全升，曲洋.固定化微生物技術及其載體在污水處理中的研究進展［J］.科技信息，2010（1）.

［23］王芳，李進，魯敏.固定化微生物技術的發展及其在印染廢水處理中的應用［J］.紡織科技進展，2010（1）：28-30.

［24］陳娜麗，馮輝霞，王冰，等.固定化細胞載體材料的研究進展［J］.化學與生物工程，2009（10）：13-17.

［25］夏黎明.固定化桔青霉產生核酸酶P1的研究［J］.微生物學報，1998，28（6）：449-453.

［26］王克明.雙載體固定化桔青霉產生核酸酶P1的研究［J］.中國糧油學報，1999，14（5）：44-46.

［27］宋威，張芹，李歡慶，等.復合載體固定化細胞發酵生產核酸酶P1的對比研究［J］.河南工業大學學報，2008，29（3）：51-54.

［28］呂浩，應漢杰.核酸酶P1的純化和酶學性質研究［J］.南京工業大學，2002，24（6）：66-69.

［29］廖紅東，莫曉燕，宋威.核酸酶P1的分離純化及部分酶學性質研究［J］.中國醫藥工業雜志，2005，36（9）：536-538.

［30］張一平，華洵璐，李靖，等.高活力5′-磷酸二酯酶制備及水解RNA的研究［J］.生物技術，2010（1）：62-65.

［31］楊大令，吳迪，張守海，等.分體式中空纖維酶膜反應器制備5′-核苷酸的研究［J］.食品工業科技，2007，28（11）：167-169.

［32］邵衛祥，莫曉燕，李黎.磁性交聯核酸酶P1聚集體的制備及性質研究［J］.西安交通大學學報，2008，42（8）：1035-1039.

Advances on the nuclease P1 fermented by Penicillium citrinum

YU Chen1，ZHAO Jie2，ZHANG Ya-xiong1，ZHU Chang-xiong2，YAO Juan2，LI Zhi-hong2
（1.Key Laboratory of Bio-engineering，China Three Gorges University，Yichang 443002，China；2.Angel Yeast Co.，Ltd.，Yichang 443003，China）

Nuclease P1 is an important industrial enzyme，it can be used for hydrolyzing nucleic acid to produce 5′-nucleotide.The strain selection，medium optimization，fermentation processcontrol，concentration，related applications and domestic and international market conditions of nuclease P1 produced by Penicillium citrinum were reviewed.

nuclease P1；Penicillium citrinum；fermentation

Q814.4

A

1002-0306（2010）11-0416-04

2010-06-28

喻晨（1985-），男，碩士研究生，研究方向：微生物代謝工程。