李紅霞，畢 陽，*，伍利芬，李科瑋，高雄杰

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070；2.甘肅農業大學農學院，甘肅蘭州730070）

采后熱水處理對蘋果梨青霉病的抗性誘導

李紅霞1，畢 陽1，*，伍利芬2，李科瑋1，高雄杰1

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070；2.甘肅農業大學農學院，甘肅蘭州730070）

由擴展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病是梨果實采后的主要病害。研究了采后45℃熱水浸泡15min處理對蘋果梨果實損傷接種P.expansum的誘抗效果及部分機理。結果表明：熱水處理后不同時間間隔（0、24、48h）接種病原物對果實病斑直徑的擴展抑制存在差異，其中以間隔48h的抑制效果最為明顯，接種后第4d的病斑直徑僅為間隔0h接種的33.2%，同樣，熱水處理后48h接種處理的病斑直徑也顯著低于同期的室溫水處理，其中以接種后第8d的差異最為明顯，為同期對照的68.7%。熱水處理可明顯提高損傷接種果實的PAL、POD和PPO活性，PAL活性在接種后第6d高出對照2.76倍，PPO活性在接種后第4d是對照的1.96倍，熱水處理還可有效增加損傷接種果實的總酚、類黃酮和木質素含量。上述結果表明，熱水處理可通過誘導果實的抗性來抑制蘋果梨損傷接種果實病斑直徑的擴展。

熱處理，果實，采后病害

蘋果梨是甘肅省名優特產，但在采后貯運過程中易受擴展青霉（Penicillium expansum）侵染而發生青霉病，雖然采用化學殺菌劑可有效控制仁果類的青霉病［1］，但均存在農藥殘留、環境污染和病原菌產生抗藥性等問題，因此急需尋找新的、更安全有效的控制方法［2］。采后熱處理具有無化學殘留、安全性高、便于操作等特性，可用于采后病害的控制［3］。據報道，采用熱空氣處理可顯著降低蘋果青霉病的病斑直徑及發病率［4-5］。但尚未見采后熱水處理對梨采后病害的控制報道。熱水處理的作用機理與其直接抑制病原物的生長和誘導產品產生抗性相關［2，6］。本文擬探討采后熱水處理對蘋果梨青霉病的誘抗效果，分析處理后果實體內的抗性生化指標變化，以豐富采后熱處理的誘抗機理。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試蘋果梨（Pyrus bretschneideri cv.Pingguoli）于2008年10月采自甘肅省國營張掖九公里園藝農場，單果包紙，紙箱包裝后運抵本校，室溫（18±2℃）下貯藏待用；供試P.expansum 分離于自然發病梨果實，PDA上保存待用。

1.2 實驗方法

1.2.1 熱水處理 選取大小均勻一致，無任何損傷果實在恒溫水浴鍋（HH-4金壇市榮華儀器制造有限公司江蘇）中45℃下浸泡處理15min，取出晾干后分別于0、24、48h后進行損傷接種。每處理用果實6個，重復3次。

1.2.2 果實損傷接種 孢子懸浮液的配置參照劉紅霞等方法并修改［7］。先將28℃下在PDA上培養4d的P.expansum孢子用含0.01%Tween-80的無菌水用玻璃棒刮下，然后轉入50mL三角瓶中，在混合器上振蕩15s，再用雙層紗布過濾，濾液用血球計數板計數算出孢子懸浮液的濃度，最后稀釋至所需濃度（2 ×106個/mL）。

果實經75%酒精表面消毒后，用滅菌鐵釘（直徑3mm）在表面等距離刺孔8個（深3mm，其中赤道部位4個，上下萼洼附近各處2個），取20μL上述孢子懸浮液接入孔內。稍作晾干后入包裝箱，塑料薄膜覆蓋保濕，于（18±2）℃，RH 85%～90%下貯藏觀測病斑直徑。

1.2.3 生化分析取樣 參照Bi等方法［8］并修改。取熱水處理后48h接種果實于處理后0、2、4、6、8、10d削取病斑以外3～5mm處的果皮1g，用直徑5mm打孔器打取病斑以外3～5mm處皮下2～3mm處果肉組織3g。鋁箔紙包裹，液氮冷凍，在-80℃超低溫冰箱中保存待用，以室溫水處理48h后接種為對照。

1.2.4 抗性酶活性測定

1.2.4.1 苯丙氨酸解氨酶（Phenylalnine ammonialyase，PAL）活性測定 參照 Assis方法［9］并修改。在290nm下測定吸光度變化，以每小時內A290變化0.01為1個活性單位（U）。酶活性單位為U/mg protein。

1.2.4.2 過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性的測定

參照Chance and Maehly方法［10］并修改。酶活性以每分鐘A470變化0.01為1個活性單位（U），表示為U/mg protein。

1.2.4.3 多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）活性測定 參考Chen等方法［11］并改進。酶活性以每分鐘A525變化0.01為1個活性單位（U），表示為U/mg protein。

1.2.5 苯丙烷代謝產物含量測定

1.2.5.1 總酚和類黃酮含量測定 參照 Pirie and Mullins方法［12］并修改。分別于280nm和325nm測定總酚和類黃酮含量。總酚含量以A280/g FW表示；類黃酮含量以A325/g FW表示。

1.2.5.2 木質素含量測定 參照 Morrison方法［13］并修改。在280nm下測定吸光度，木質素含量以A280/g FW表示。

1.2.6 蛋白含量測定 參照Bradford方法測定［14］，以牛血清蛋白（BSA）為標準蛋白作標準曲線，計算蛋白含量，上述各項生化分析均設平行樣6個，重復3次。

1.2.7 數據統計 病斑直徑數據處理用 Microsoft Excel 2003和DPS3.01數據處理系統計算標準偏差（±SE）并進行Duncan’s多重差異顯著分析，其余數據統計后計算標準偏差（±SE）。

2 結果與分析

2.1 熱水處理后不同時間間隔和不同溫度處理后48h損傷接種P.expansum對病斑直徑的影響

熱水處理后不同時間間隔接種病原物對果實病斑直徑的影響存在差異。以間隔0h接種病斑直徑最大，間隔24、48h后接種均能夠顯著抑制病斑直徑的擴展，其中以間隔48h的效果最為明顯，不僅在接種后的10d內病斑直徑均顯著低于0h接種，而且接種后第2d和4d的病斑直徑僅是0h接種的39.8%和33.2%（圖1A）。同樣，熱水處理后48h接種處理的病斑直徑也顯著低于同期的室溫水處理對照，其中以接種后第6d和8d的差異最為明顯，分別為同期對照的73.2%，68.7%（圖1B）。

圖1 熱水處理后不同時間間隔（A）和不同溫度處理后間隔48h（B）損傷接種P.expansum對病斑直徑的影響

2.2 熱水處理對果實體內3種抗性酶活性和3種抗性物質含量的影響

熱處理可以顯著提高果實體內的3種抗性酶活性，其中以PAL變化最為明顯。在培養期間處理和對照的PAL的活性均呈單峰形變化，但處理果實的PAL活性始終明顯高于對照，在第6d差異達到最大，比對照高出2.76倍（圖2A）。同樣，熱處理也明顯提高了果實的POD和PPO活性，處理組的PPO在前4d迅速上升，在第8d達到最大值，后迅速下降，而對照組在前6d緩慢上升且在第6d達到最大酶活，在第4d時差異最顯著，處理組活性是對照的1.96倍，但是處理組始終高于對照。POD的活性變化與PPO基本一致（圖2B，2C）。

熱處理可以在一定程度上提高梨果實體內的總酚和木質素含量，其中以木質素含量變化較為明顯（圖2F）。總酚含量除了處理后第2d和10d外，均高于對照（圖2D），熱水處理還有效提高了類黃酮含量（圖2E）。

3 討論

熱水處理后48h果實損傷接種P.expansum的病斑直徑顯著低于室溫水處理的對照（圖1B），表明熱處理可以通過誘導果實體內的抗病性來有效抑制病斑直徑的擴展。熱水處理后間隔48h損傷接種P.expansum的病斑直徑顯著低于間隔0h和24h（圖1A），說明熱水處理對果實抗病性的誘導具有周期性。PAL、POD和PPO活性，以及總酚、類黃酮和木質素含量是指示果實抗病性是否被誘導的重要生化指標［4］。熱水處理后果實體內的PAL、POD和PPO活性明顯提高，以及總酚、類黃酮和木質素含量的增加（圖2），表明熱水處理激活了果實體內的抗性生化反應［4］。該結果與邵興峰等的研究結果基本一致［4］。PAL是苯丙烷類代謝途徑中的第一關鍵酶，它與酚類物質、木質素及植保素等抗病物質的合成有關，該酶活性越高，說明果實的抗病性越強［15］。PPO可使果實體內積累的酚類物質氧化成高毒性的醌類物質，進而起到對病原物的毒殺作用，從而抑制病原物的生長［16］。POD可催化酚類物質的前體聚合為木質素，起到加固植物細胞壁、抵抗病原物侵襲的作用，還是細胞內清除自由基的保護酶。熱水處理提高了POD活性，有利于木質素和植保素的合成，增加了細胞壁的抗病能力［17］。熱水處理還顯著提高了梨果實內三種重要的抗性物質總酚、類黃酮和木質素的含量，從而提高了梨果實的抗病性。類黃酮作為植物保衛素具有抑制真菌孢子萌發、芽管伸長、菌絲生長作用［18］。酚類物質在PPO作用下可氧化成能對病原菌產生直接毒性的醌類物質，能有效抑制病原菌的擴展［16］。木質素可形成阻止病原物侵入寄主的機械屏障，加強了寄主抗真菌的能力［19］。

綜上所述，熱水處理對蘋果梨青霉病的抑制與其增強果實體內的苯丙烷代謝密切相關。此外，還有一些其他的抗性機理涉及其中，尚需進一步探討。

圖2 熱水處理和P.expansum挑戰接種對果實體內PAL（A）、POD（B）和PPO（C）活性以及總酚（D）、類黃酮（E）和木質素（F）含量的影響

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Post-harvest hot water treatment induces resistance against Penicillium expansum in pear fruit

LI Hong-xia1，BI Yang1，*，WU Li-fen2，LI Ke-wei1，GAO Xiong-jie1
（1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.College of Agronomy，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

Blue mold caused by Penicillium expansum was a major post-harvest disease in pear.lnduction resistance effect and partial mechanisms of post-harvest hot water dipping in 45℃ for 15min against blue mold inoculated with P.expansum in pea（rcv.Pingguoli）were investigated.The results showed that different inoculation interva（l0，24，48h）after hot water treatment had a difference lesion diameter.The interval of 48h had the smallest lesion diameter，which was 33.2%of 0h interval.Meanwhile hot water treatment at interval 48h inoculation had a smaller lesion diameter，and was 68.7%of the control after 8d of inoculation.Hot water treatment significantly enhanced the activity of phenylalnine ammonialyase（PAL）peroxidase（POD）and polyphenol oxidase（POD）in fruit inoculated with P.expansum.The activity of PAL and PPO were 2.76 and 1.96 times higher than the control after 6d and 4d of inoculation.Hot water treatment also increased the content of total phenolics flavonoid and lignin.lt is suggested that hot water treatment inhibits the lesion diameter of pear fruit inoculated with P.expansum by induction resistance.

hot water treatment；fruit；post-harvest disease

TS255.3

A

1002-0306（2010）11-0329-03

2009-11-04 *通訊聯系人

李紅霞（1982-），女，在讀碩士，研究方向：果蔬防腐與保鮮。

國家支撐計劃（2006BAD22B02）。