均勻設計與正交設計聯用優選鐵皮石斛多糖提取工藝的研究

周術濤，雷志力，俞巧仙，葉智根

（森宇控股集團有限公司，浙江義烏322000）

均勻設計與正交設計聯用優選鐵皮石斛多糖提取工藝的研究

周術濤，雷志力，俞巧仙，葉智根

（森宇控股集團有限公司，浙江義烏322000）

目的：優選簡便高效的鐵皮石斛多糖的提取工藝，考察不同條件下的總多糖得率。方法：采用均勻設計與正交設計聯用的方法對鐵皮石斛多糖的提取工藝進行優選。結果：優選出來的鐵皮石斛最佳提取工藝條件為溫度85℃，提取時間3h，液料比20倍時，提取的總多糖得率最高為24.9%。結論：正交設計與均勻設計聯用是優選工藝的好方法，本實驗所得工藝合理，提取率高，適用于工業生產。

均勻設計，正交設計，鐵皮石斛多糖，提取工藝

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）為蘭科石斛屬藥用植物，又名黑節草，是一種非常珍貴的中藥，具有益胃生津、滋陰清熱、潤肺止咳的功效。臨床一般將其用于治療陰傷津虧，口干煩渴，食少干嘔，病后虛熱，目暗不明等疾病，特殊用于慢性萎縮性胃炎及降血糖、抗腫瘤、抗衰老等。現代藥理研究表明，其主要成分是鐵皮石斛多糖，能顯著提高SOD（超氧化物歧化酶）水平，從而降低LPO（過氧化脂質），達到清除體內自由基的作用。鐵皮石斛生理活性的強弱與其多糖的含量有一定關系，常以其高低來判斷某一石斛類藥材質量的好壞。本實驗通過均勻設計粗選鐵皮石斛多糖提取工藝，并在此基礎上選取水平因素范圍做正交實驗，采用直觀分析的方法對鐵皮石斛多糖的提取工藝進行優選，均勻設計與正交設計的聯用，從而使優選出的工藝更加優化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鐵皮石斛 干燥莖，由浙江省森宇實業有限公司提供；葡萄糖 分析純，北京慶盛大化工技術有限公司。

KQ-250DE型數控超聲波 昆山市超聲儀器有限公司；UV-9200紫外分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；TDL-5型離心機 上海安亭科學儀器廠；旋轉蒸發儀 上海申生科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鐵皮石斛多糖含量測定方法的確定 多糖在濃硫酸作用下可以被水解成單糖，單糖在濃硫酸作用下脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在10～100μg范圍內，其顏色的深淺與糖的含量呈正比，且在490nm波長下有最大吸收峰，故可用硫酸-苯酚（5%）法［2］顯色，再采用分光光度法進行測定。

1.2.1.1 5%苯酚溶液的配制 取苯酚適量，蒸餾收集180～182℃的餾分，稱取餾分12.5g，置250mL的容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得5%苯酚溶液，將溶液避光，冷藏。

1.2.1.2 葡萄糖標準溶液的配制 精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標準品3.125g，將其定容于250mL容量瓶中，吸取2mL溶液定容于100mL的容量瓶中，搖勻，得到濃度為250μg/mL的標準溶液。

1.2.1.3 標準曲線的繪制 精密量取葡萄糖標準溶液0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5mL分別置于50mL容量瓶中定容，精密吸取上述供試液1.0mL于試管中，分別加入5%苯酚溶液0.6mL，濃硫酸3.0mL，充分搖勻，放置60℃水浴中20min，在490nm波長處測吸光度，以吸光度（Y）為縱坐標，葡萄糖濃度（X）為橫坐標進行線性回歸，求得回歸方程式：

式中，X為糖濃度，μg/mL；Y為吸光度值；n=5。

由回歸方程可知，糖濃度在12.5～62.5μg/mL之間有良好的線性關系。

1.2.2 樣品中總多糖得率的計算 精密量取1.0mL的供試品溶液，定容于適當體積的容量瓶中，搖勻。精密吸取上述稀釋液1.0mL于試管中，分別加入5%苯酚溶液0.6mL，濃硫酸3.0mL，充分搖勻，放置60℃水浴中20min，在490nm波長處測定其吸光度（Y），代入回歸方程求得多糖濃度（C）。

式中，C為多糖濃度，mg/mL；Y為吸光度；n為稀釋倍數。

鐵皮石斛粉質量為m，提取液體積為V，則由式（3）求得總糖得率W：

式中，C為多糖濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；m為石斛粉質量，g；W為石斛粉質量，%。

1.2.3 提取工藝 將干燥鐵皮石斛粉碎，過60目篩。取一定量鐵皮石斛粉，熱水浸提，調節適當溫度和液料比，保溫提取一定時間（提取3次），過濾，濾液經醇析，離心得粗多糖，復溶脫蛋白，醇析得粗多糖，采用苯酚硫酸法測量鐵皮石斛多糖的含量。提取工藝流程如下：

原料→稱重→熱水浸提→過濾濾液醇析→離心得多糖粗品→復溶→脫蛋白→醇析→粗多糖→計算總多糖得率

表1 均勻設計實驗因素水平表

表2 正交設計實驗因素水平表

2 實驗結果分析

2.1 均勻實驗設計與結果

均勻實驗結果如表3所示。由表3可以看出，以鐵皮石斛總糖為考察指標，第6號實驗所得總多糖提取率較高。此時工藝條件為：溫度 90℃，時間2.5h，液料比18倍。

表3 均勻設計實驗結果

2.2 正交實驗設計與結果

從均勻設計實驗結果分析來看，以均勻設計6號的實驗的各因素的水平數為基準上下浮動取值，也可考慮單水平作用效果，對各因素的水平進行合理取值，在此基礎上，正交實驗的因素水平表設計如表2；表4為正交實驗及結果。

表4 正交實驗及結果

由表4可知，對得率影響最大的因素是提取溫度，其次是液料比，再次是提取時間。鐵皮石斛多糖的最優工藝條件為：A2B3C3，即提取溫度為85℃，提取時間3h，液料比為20倍。經測定，在此最優工藝下，鐵皮石斛多糖的得率可達24.9%。

3 討論

3.1 本實驗通過均勻設計與正交設計聯用，篩選得最佳工藝條件為：提取溫度為85℃，提取時間3h，液料比為20倍。

3.2 均勻設計與正交設計聯用的優點：將兩種設計方法有機結合，可以揚長避短，無論在藥理學研究還是在制劑生產工藝參數的優化研究中，都可以在省時、省力、省錢的基礎上在整個實驗范圍內盡快找到最佳的提取工藝條件，使均勻設計的實驗次數大為減少，使正交設計能夠進行直觀分析的優點在藥學研究中更好地發揮出來。

3.3 由于正交實驗設計實驗次數的跳躍性和均勻設計分析對分析人員的數理統計知識的嚴格要求等條件因素，使這兩種設計方法在藥學研究中的應用受到一定程度的限制。將均勻設計與正交設計聯用是有其理論基礎的，對均勻實驗設計而言，如果沒有計算機處理數據，也可以從實驗中找到一個最優的指標，相應實驗的條件為優選的工藝條件，這種方法建立在均勻性的基礎之上，由于實驗點分散均勻，實驗中最優的工藝條件離實驗范圍內的最優工藝條件不是很遠，所以還是有效的。

［1］Li W M，Gao Y，Li D H.Application of uniform design method used to select proportion of ingredients in Houpuwan［J］. Chin J Exp Trad it Med Form，2001（2）：18-20.

［2］羅立新，姚汝華.靈芝多糖生產工藝的研究［J］.食品工業科技，1996（6）：60-62.

［3］熊麗萍，萬屏南，衷友泉.幾種石斛多糖的提取分離及其抗氧化性能研究［J］.江西中醫學院學報，2006，18（4）：55-56.

［4］何鐵光，楊麗濤，李陽瑞，等.鐵皮石斛原球莖多糖提取最佳工藝研究［J］.西北農業學報，2006，15（5）：240-243.

［5］王海波，沙明，邸學.均勻設計法與正交設計法在復方工藝中應用比較［J］.遼寧中醫雜志，2005，32（1）：71-72.

［6］路世鵬，王玉蓉.均勻設計和正交設計法優選吳茱萸提取工藝的研究［J］.北京中醫藥大學學報，2004，27（5）：66-69.

［7］張蘭蘭，黃昌全，張忠義，等.均勻設計與正交設計在鉤吻生物總堿提取工藝篩選研究中的應用［J］.第一軍醫大學學報，2003，23（9）：914-924.

Study on the preferred extraction of polysaccharides from dendrobium candidum with uniform design and orthogonal design

ZHOU Shu-tao，LEI Zhi-li，YU Qiao-xian，YE Zhi-gen
（Senyu Holding Group Co.，Ltd.，Yiwu 322000，China）

Objective：Simple and efficient extraction process of polysaccharides from dendrobium candidum was optimized，the yield of the total polysaccharides under different conditions was investigated.Methods：Uniform design and orthogonal design methods were used to optimize the process of extracting polysaccharide.Results：The optimal extraction condition was temperature 85℃，extraction time 3h，liquid material ratio 20 times，the highest total polysaccharides extracted rate was 24.9%.Conclusion：Orthogonal design combined with uniform design was a good way for process optimization.The process obtained by the experiment with high extraction rate was reasonable and suitable for industrial production.

uniform design；orthoganal design；dendrobium candidum polysaccharide；extraction

TS201.1

B

1002-0306（2010）11-0296-03

2009-11-13

周術濤（1982-），男，碩士，研究方向：天然產物及中藥工藝制備。