納豆枯草芽孢桿菌生物發(fā)酵川穹嗪初探

劉曉杰，章海鋒，陳繼承，翁育輝，陳啟和，何國(guó)慶

（浙江大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)系，浙江杭州310029）

納豆枯草芽孢桿菌生物發(fā)酵川穹嗪初探

劉曉杰，章海鋒，陳繼承，翁育輝，陳啟和*，何國(guó)慶

（浙江大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)系，浙江杭州310029）

據(jù)資料顯示，納豆芽孢桿菌具有生物合成川穹嗪（TMP）等吡嗪類(lèi)物質(zhì)的特性，但并未深入展開(kāi)研究。本文考察了液體發(fā)酵培養(yǎng)和固體發(fā)酵過(guò)程中底物乙偶姻（ACT）的加入時(shí)間、乙偶姻添加量及種子液的加入量對(duì)TMP生物合成的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，液體培養(yǎng)基組成為20%大豆浸泡物、0.5%乙偶姻時(shí)最有利于TMP的合成；固體發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)前體在培養(yǎng)84h時(shí)加入TMP的合成量最高，TMP產(chǎn)率隨底物乙偶姻加入量的增加而增加，與種子液的加入量呈負(fù)相關(guān)。關(guān)鍵詞：川穹嗪，納豆，乙偶姻，生物合成

川穹嗪，即四甲基吡嗪（tetramethypyrazine，TMP），分子式C8H12N2，分子量136.20，無(wú)色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)80～82℃（顯微鑒別）、沸點(diǎn)190℃，具有特殊異臭，有吸濕性，易升華，易溶于熱水、石油醚，溶于氯仿、稀酸，不溶于冷水，是從川穹總生物堿中分離出來(lái)的一種具有多種生物活性的酰胺類(lèi)生物堿，臨床上廣泛用來(lái)治療心血管疾病［1］。其作用機(jī)制在于川穹嗪可以改善血液流變性、防止血栓形成，影響內(nèi)皮素和一氧化氮含量，抑制鈣超載，抗自由基損傷，影響凋亡相關(guān)基因和細(xì)胞因子［2］。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，川穹嗪還可以調(diào)節(jié)干預(yù)抑制肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）核因子（NF-KB）活化，減輕失血性休克并內(nèi)毒素誘發(fā)的急性肺損傷；在異體腎移植后減輕腎小球病理?yè)p害及保護(hù)腎功能；對(duì)兔高眼壓視神經(jīng)軸突起保護(hù)作用，對(duì)慢性高眼壓下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和雙極細(xì)胞具有保護(hù)作用；拮抗心力衰竭時(shí)心房纖維化及心房顫動(dòng)的發(fā)生；治療支氣管哮喘及免疫調(diào)控；對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠實(shí)驗(yàn)性肝纖維化有明顯的保護(hù)和治療作用［1］。目前，溶劑法是獲得川穹總提物最常用的一種方法。該法是將藥材粉碎后，用有機(jī)溶劑（一般為乙醇）浸泡后，多次回流提取，提取液過(guò)濾濃縮后，再流經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂柱，收集30%乙醇洗脫液，得到川穹總提取物［3-4］。盡管該法工藝成熟，但作為川穹嗪的主要獲取方式，川穹中0.1%～0.2%的含量仍不能很好地滿(mǎn)足人們?cè)诳蒲小⒅扑幍确矫娴男枨蟆１M管川穹嗪在化學(xué)合成方面已經(jīng)獲得許多進(jìn)展，但損耗大、化學(xué)殘留高、安全性不高等因素限制其在實(shí)際中應(yīng)用。納豆是大豆經(jīng)發(fā)酵制成的日本傳統(tǒng)食品，其特征成分甲基吡嗪（MPs）的種類(lèi)和含量備受關(guān)注［8-9］。因此通過(guò)微生物發(fā)酵合成研究納豆芽孢桿菌合成川穹嗪的合適方式和條件，以拓展納豆的功效，為工業(yè)化生產(chǎn)高TMP活性的納豆提供理論指導(dǎo)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆 市售；葡萄糖、天冬氨酸、基礎(chǔ)氮源 購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度為分析純；乙偶姻、TMP標(biāo)準(zhǔn)品 99.9%純度，均購(gòu)自Sigma公司；菌種 納豆芽孢桿菌B.subtilis Natto由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

Technologies 1200Series液相色譜儀 Agilent；色譜柱 ZORBAX SB-C18（4.6×100mm，1.8μm）；LDIX -4011型立式蒸汽滅菌消毒器 上海中安醫(yī)療器廠；LRH-150生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆液體發(fā)酵方法 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的配制見(jiàn)表1所示。

表1 液體發(fā)酵的培養(yǎng)基組成（pH 7.3～7.5）

在37℃進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化，接種量為2%，發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速200r/min，在500mL搖瓶中裝量為150mL，轉(zhuǎn)化3d后取樣提取分析。

1.2.2 大豆固體發(fā)酵工藝流程 大豆的固體發(fā)酵流程采用的是納豆生產(chǎn)工藝，具體流程如下：

精選的大豆→洗凈→浸泡→煮大豆→攤涼→接種發(fā)酵→放置后熟→成熟納豆

固體發(fā)酵步驟：大豆經(jīng)流水浸泡24h；三角瓶封裝100g/瓶；立式蒸汽滅菌器121℃滅菌20min；接種（接種量為5%，m/v）；培養(yǎng)3～4d；加前體物乙偶姻，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 發(fā)酵樣品的處理 采用溶劑提取方法進(jìn)行萃取，5g樣品+25mL三氯甲烷超聲波提取1h，加25mL 0.2mol/L鹽酸萃取，同時(shí)進(jìn)行快速分析。

1.2.4 ACT、TMP同步HPLC檢測(cè)條件 流動(dòng)相：1%醋酸水溶液∶甲醇=45%∶55%，0.5‰三氟乙酸；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：290nm；柱溫：45℃；進(jìn)樣量：2μL；跑樣時(shí)間：10min。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作 不同梯度TMP標(biāo)準(zhǔn)品的溶液配制：0.2、4、8、12、16、20、40、80μg/mL。TMP標(biāo)準(zhǔn)溶液的線(xiàn)性關(guān)系考察：以TMP濃度C為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)作圖，得回歸方程y=5.901x-1.725，R2=0.999934。

不同梯度乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)品的配制：0.05、1、2、3、4、5、10、20mg/mL乙偶姻標(biāo)準(zhǔn)溶液的線(xiàn)性關(guān)系考察：以乙偶姻濃度C為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)作圖，得回歸方程y=26.5x-1.48，R2=0.999944。

2 結(jié)果與討論

2.1 液體發(fā)酵對(duì)大豆轉(zhuǎn)化合成TMP的影響

不同發(fā)酵方式對(duì)大豆原料轉(zhuǎn)化合成TMP的影響具有明顯不同差異，其中對(duì)不同處理方式和前體添加對(duì)轉(zhuǎn)化合成TMP的影響進(jìn)行了深入探討，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 大豆液體發(fā)酵不同處理方式對(duì)ACT、TMP的影響

從圖1結(jié)果可以看出，8號(hào)培養(yǎng)基對(duì)TMP合成具有顯著促進(jìn)效果。與9號(hào)培養(yǎng)基相比，是否添加前體對(duì)TMP合成具有顯著影響。從圖中結(jié)果也可以看出不同培養(yǎng)基組成對(duì)ACT利用率影響的差異。

2.2 固體發(fā)酵方式對(duì)納豆芽孢桿菌合成TMP的影響

2.2.1 底物加入時(shí)間對(duì)TMP產(chǎn)率的影響 以下所有大豆接種發(fā)酵的時(shí)間均為144h，圖表中的X軸代表加入底物的不同時(shí)間。底物添加量為200μg/瓶100g，種子液接入量2%。從圖2中結(jié)果可以看出，底物于納豆發(fā)酵84h后添加最有利于納豆中TMP的合成。

圖2 底物加入時(shí)間對(duì)TMP合成量的影響

2.2.2 底物加入量對(duì)TMP產(chǎn)率的影響 為了考察ACT不同添加量對(duì)納豆中TMP合成的影響，本部分主要研究了幾種添加量對(duì)TMP合成量的差異，底物乙偶姻的加入時(shí)間為發(fā)酵開(kāi)始的84h，接種量為2%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，從圖3結(jié)果可以看出，添加量提高，其TMP合成的量也隨之升高，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)具有線(xiàn)性關(guān)系。從這些研究數(shù)據(jù)不難看出，ACT和TMP合成之間存在著必然的關(guān)系，而且這種關(guān)系在一定程度內(nèi)是線(xiàn)性的，線(xiàn)性回歸方程y=4.4428x-7.3039，R2=0.822。

圖3 底物加入量對(duì)TMP合成量的影響

2.2.3 納豆芽孢桿菌接種量對(duì)TMP合成的影響 本部分考察了納豆發(fā)酵中不同接種量對(duì)TMP合成影響，以探討納豆芽孢桿菌是否對(duì)TMP合成產(chǎn)生必然影響。前體乙偶姻的添加時(shí)期為發(fā)酵84h，添加量為200μL/100g。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4所示，從圖中結(jié)果不難分析，1%的接種量為納豆產(chǎn)TMP的合適菌量，當(dāng)然這個(gè)接種量并不一定是其最佳加量，還有待深入研究和探討。

圖4 納豆芽孢桿菌接種量對(duì)TMP合成量的影響

3 結(jié)論

3.1 液體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，底物乙偶姻的添加對(duì)納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)TMP有重要影響，發(fā)酵培養(yǎng)基以20%大豆浸泡物、0.5%天冬氨酸、2%葡萄糖對(duì)底物乙偶姻的合成最為有利。以20%大豆浸泡物、0.5%乙偶姻最有利于TMP的合成。

3.2 固體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)?shù)孜镆遗家龅募尤肓繛?00μg/100g黃豆、接種量為2%、在培養(yǎng)84h時(shí)加入TMP的合成量最高，產(chǎn)率為12.809μg/g黃豆。

3.3 固體發(fā)酵TMP的產(chǎn)率隨底物乙偶姻加入量的增加而增加，當(dāng)乙偶姻的加入量為500μg/100g黃豆時(shí)，TMP產(chǎn)率為18.525μg/g黃豆。

3.4 固體發(fā)酵當(dāng)乙偶姻的加入量為200μg/100g黃豆，底物加入時(shí)間為84h時(shí)，TMP產(chǎn)率為與種子液的加入量呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)接種量為 1%時(shí)，產(chǎn)率為9.221μg/g黃豆。

［1］李秀萍，王紅勤，高勵(lì)聰.川穹嗪臨床應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)冶金工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2007，24（4）：421-424.

［2］晏亦林，周莉玲.川穹嗪的研究概況［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19（6）：1343-1345.

［3］鄒賢明，劉寶生.川穹提取工藝研究［J］.中華臨床醫(yī)學(xué)研究雜志，2008，15（11）：1615-1616.

［4］趙慧萍.川穹提取工藝的研究［J］.中華醫(yī)學(xué)叢刊，2004，4（10）：21-22.

［5］加沼綠［日］.用HPLC法分析納豆中的甲基吡嗪類(lèi)化合物［J］.藥學(xué)雜志，2004，124（13）：1-36.

［6］余慶斌，李永進(jìn)，方建國(guó).高效液相色譜法測(cè)定磷酸川穹嗪氯化鈉注射液中川穹嗪的含量［J］.中國(guó)藥師，2003，6（8）：493.

［7］劉本，Dean J R，Rachel P.法多索溶劑和超臨界流體提取川穹中的川穹嗪［J］.中國(guó)醫(yī)藥雜志，1993，30（5）：196-199.

［8］Besson I，Creuly C，Gros J B，et al.Pyrazine production by Bacillus subtilis in solid-state fermentation on soybean［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1997，47（5）：489-495.

［9］ZijunXiao，Jian R Lu，CuiqingMa.Formation and identification of trimethylimidazole during tetramethylpyraze production from glucose by Bacillus strains［J］.Biotechnol lett，2009，31（9）：1421-1425.

A pilot study on the biological synthesis of methypyrazine by Bacillus subtilis natto

LIU Xiao-jie，ZHANG Hai-feng，CHEN Ji-cheng，WENG Yu-hui，CHEN Qi-he*，HE Guo-qing
（Department of Food Science and Nutrition，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China）

lt is reported that Bacillus subtilis natto had the ability to synthesize methypyrazine（TMP），but there is no profound investigation.The aim of this paper was to study the impact of the composition of culture medium in liquid fermentation，the addition time and the amount of acetoin，the inoculum level of Bacillus subtilis natto on the formation of TMP in solid-state fermentation.Results showed that liquid medium composed of 20%of soybeans soaked material，0.5%acetoin was the most beneficial to the synthesis of TMP.The highest TMP yield was obtained when acetoin was added in 84h culture time.The synthesis of TMP has positive coorelation with the adding dosage of acetoin，whereas has negative relation with the inoculum level of Bacillus subtilis natto.

TMP；Bacillus subtilis natto；ACT；biological synthesis

TS201.3

A

1002-0306（2010）11-0187-03

2009-10-21 *通訊聯(lián)系人

劉曉杰（1986-），女，碩士研究生，研究方向：生物代謝工程。

國(guó)家科技部“十一五”支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2006BAD27B09）。