西維因單鏈抗體基因克隆、表達及活性分析

王俊平，張偉偉，杜欣軍，吳懿娜，董 峰，王 碩

（食品營養(yǎng)與安全省部共建教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津300457）

西維因單鏈抗體基因克隆、表達及活性分析

王俊平，張偉偉，杜欣軍，吳懿娜，董 峰，王 碩*

（食品營養(yǎng)與安全省部共建教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津300457）

利用兼并引物從西維因單克隆雜交瘤細胞的cDNA中克隆得到抗體基因的輕鏈可變區(qū)（VL）和重鏈可變區(qū)（VH），長度分別為324bp和360bp，將其分別連接入pGEM-T-Easy載體進行測序；根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計特異性引物和連接序列（Gly4Ser）3，利用重疊延伸PCR擴增得到長度為729bp的單鏈抗體基因片段（scFv），亞克隆至原核表達載體pET30a（+），并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞BL21（DE3）進行誘導表達；聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）結(jié)果顯示，重組表達單鏈抗體形成包涵體，分子量大小約為33kDa，變性后利用不同條件進行復性，結(jié)果顯示最佳復性時間為48h，最佳起始蛋白濃度為200μg/mL，含有精氨酸的復性液效果最佳；利用親和層析純化scFv，并利用競爭ELISA檢測其活性，結(jié)果顯示該scFv對西維因具有良好的親和性和特異性。

西維因，單鏈抗體，克隆，表達，活性

西維因（Carbaryl）是氨基甲酸酯類農(nóng)藥的一種，廣泛用于防治稻、麥、棉、果樹、蔬菜等作物害蟲，畜禽外寄生蟲和衛(wèi)生害蟲。它是一種接觸性殺蟲劑，兼有內(nèi)吸活性，如殘留在體內(nèi)，能抑制膽堿酯酶，使乙酰膽堿在組織中蓄積，進而導致流涎、惡心、流淚、瞳孔縮小、視力模糊、痙攣等，甚至造成致畸、慢性神經(jīng)中毒等嚴重危害，其在作物和蔬菜上的農(nóng)藥殘留會對人體健康造成較大的危害［1-2］。目前用于檢測農(nóng)藥殘留的方法很多，而酶聯(lián)免疫技術(shù)以其靈敏度高，適合于檢測大量樣品以及成本低、無需大型昂貴儀器設(shè)備等優(yōu)點，越來越受到歡迎［3］。為了建立西維因的酶聯(lián)免疫分析方法，首先必須制備特異性好的抗體。而單鏈抗體是用基因工程方法將抗體的輕鏈可變區(qū)（VL）和重鏈可變區(qū)（VH）通過一段連接肽（linker）連接而成的重組蛋白，是保持了親本抗體全部特異性和結(jié)合能力并具有最小的結(jié)構(gòu)單位的小分子。scFv具有能在細菌中表達，易于基因操作和大量生產(chǎn)等優(yōu)點，這對于西維因大規(guī)模檢測及檢測產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化具有重要意義［4-5］。本實驗從能分泌特異性西維因單克隆抗體的雜交瘤細胞中分離純化西維因單鏈抗體的基因，并在大腸桿菌中進行高效表達，通過透析復性的方法獲得具有抗原結(jié)合活性的單鏈抗體。

表1 scFv克隆所用引物

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西維因雜交瘤細胞 本實驗室制備；總RNA提取試劑 上海博星基因芯片有限責任公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒 Fermentas公司；Pfu DNA聚合酶、pET30a（+）質(zhì)粒載體、大腸桿菌BL21（DE3） Promega公司；His-Bind樹脂 Novagen公司；西維因酶標抗原本實驗室合成；PCR引物 上海生物工程公司合成。

PCR儀、SDS-GAGE系統(tǒng)、冷凍離心機 Bio-Rad公司；超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 VL、VH克隆及測序鑒定 從1×106個雜交瘤細胞中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用兼并引物分別擴增 VL和VH［6］，PCR反應(yīng)條件為：94℃，5min；94℃，1min；53℃，1min；72℃，1min，循環(huán)35次；72℃，10min。電泳檢測擴增結(jié)果，膠回收PCR產(chǎn)物。將回收產(chǎn)物連接到pGEM-T-Easy載體，經(jīng)酶切鑒定與PCR鑒定后進行測序，并對測序結(jié)果進行分析鑒定。1.2.2 scFv基因片段克隆 根據(jù)測序結(jié)果，重新設(shè)計引物VLF和VLR，VHF和VHR（表1），分別從VL-pGEM-T-Easy質(zhì)粒和VH-pGEM-T-Easy質(zhì)粒擴增VL和VH片段，之后通過兩步法將VL，VH進行重疊延伸獲得scFv基因片段；將膠回收的VL和VH等量混合后加入50μL的PCR反應(yīng)體系中，進行無引物延伸反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃，1min；58℃，1min；72℃，1min，反應(yīng)進行10個循環(huán)；反應(yīng)后，向反應(yīng)體系中加入引物VHF、VLR及Pfu DNA聚合酶進行第2步反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃，1min；63℃，1min；68℃，1min，循環(huán)20次。電泳檢測擴增結(jié)果。

1.2.3 重組表達載體構(gòu)建與誘導表達 用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切膠回收的scFv，之后將其連接到同樣雙酶切的pET30a（+）質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）。挑取抗性生長克隆增菌培養(yǎng)，并用0.1mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），37℃，200r/min誘導5h。收集菌液進行SDS-PAGE檢測。

1.2.4 包涵體復性的條件優(yōu)化

1.2.4.1 包涵體的分離與變性 根據(jù)SDS-PAGE檢測鑒定結(jié)果，取陽性克隆IPTG誘導培養(yǎng)，收集細菌。用超聲方法破碎細胞。10000×g，4℃離心20min收集沉淀。沉淀用包涵體洗滌液A（50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，pH=8.0）洗滌2次，用包涵體洗滌液B（50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，8mol/L脲，pH=8.0）洗滌2次，加入包涵體變性緩沖液（0.1mol/L Tris-HCl，10mmol/L DTT，8mol/L脲，pH =8.0），37℃，200r/min，快速振蕩1h。10000×g，4℃離心20min，收集上清［7］。

1.2.4.2 最佳復性條件的確定 用變性液將變性蛋白濃度稀釋至200μg/mL，于50倍體積的復性液Ⅰ（0.1mol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，pH=8.0）中4℃分別透析 12、24、36、48h，每 12h更換一次透析液。

用變性液將變性蛋白分別稀釋至500、200、100、50μg/mL，于50倍體積的復性液Ⅰ（0.1mol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，pH=8.0）中4℃分別透析48h。

分別在復性液Ⅰ中加入5mmol/L還原型谷胱甘肽（GSH）和0.5mmol/L氧化型谷胱甘肽（GSSG），5%甘油，0.4mol/L L-精氨酸（L-Arg），分別進行透析復性。

以上各方法透析產(chǎn)物經(jīng)4℃，10000×g離心20min。Bradford法測抗體濃度，計算復性率。復性率計算公式：蛋白復性率（%）=復性后樣品量/復性起始樣品量×100%，最后采用最優(yōu)條件進行透析復性。

1.2.5 scFv純化與活性鑒定 按照試劑說明書步驟，過His-Bind親和層析柱純化復性蛋白，Bradford法測抗體濃度，SDS-PAGE檢測純化效果。

用競爭ELISA法分析純化抗體的活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 VL和VH基因擴增及測序

從西維因雜交瘤細胞中，利用小鼠抗體基因簡并引物，分別PCR擴增單克隆抗體可變區(qū)VL和VH基因。將擴增得到的單鏈抗體基因進行序列測定，并對輕鏈和重鏈測序結(jié)果進行序列比對，結(jié)果表明克隆序列為小鼠抗體可變區(qū)基因片段，片段長度分別為324bp和360bp（圖1）。

圖1 VL、VH基因片段擴增M：DNA Marker；1：VH；2：VL。

2.2 scFv基因克隆

根據(jù)輕重鏈可變區(qū)測序結(jié)果重新設(shè)計輕、重鏈引物，運用重疊延伸法將輕、重鏈可變區(qū)連接形成scFv，片段大小為729bp（圖2），核苷酸及氨基酸序列如圖3所示。

圖2 scFv PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 西維因單鏈抗體scFv基因片段序列

2.3 重組表達

將單鏈抗體進行雙酶切，與同樣雙酶切的pET30a（+）連接，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，提取質(zhì)粒，進行PCR和酶切驗證（圖4）。

圖4 重組表達質(zhì)粒scFv-pET30a（+）鑒定

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3），挑取單菌落進行誘導表達，SDS-PAGE顯示目的蛋白存在于菌體破碎后的沉淀中，即形成了包涵體，分子量大小約為33kDa（圖5）。

2.4 復性條件優(yōu)化

2.4.1 復性時間的優(yōu)化 分別測定不同復性時間下2：菌體破碎后的上清液；3：IPTG誘導后菌體；4：未誘導菌體。的蛋白復性率，可知在48h以上復性率差異不大（圖6），由此確定最佳復性時間為48h。

圖5 scFv在BL21（DE3）中誘導表達

圖6 復性時間的優(yōu)化

2.4.2 復性蛋白起始濃度的優(yōu)化 分別測定不同起始濃度的復性率，可知復性率隨起始蛋白濃度升高而降低，但由于總體復性量在200μg/mL時最高（圖7），所以選擇此起始蛋白濃度為最適蛋白起始濃度。

圖7 復性起始濃度的優(yōu)化

2.4.3 復性液組成成分進行的優(yōu)化 分別測定復性率，可知L-Arg的添加對復性率有很大提高（圖8），由此確定復性液成分為0.1mol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，0.4mol/L L-Arg，pH=8.0。

圖8 復性液成分優(yōu)化

2.5 scFv活性鑒定

2.5.1 復性抗體的親和純化 將包涵體進行破碎，洗滌，變性，在最優(yōu)條件下（起始蛋白濃度為200μg/mL；復性液為0.1mol/L Tris-HCl，5mmol/L EDTA，0.4mol/L L-Arg，pH=8.0；4℃復性48h）進行透析復性后，用Bradford法測抗體濃度約為40μg/mL菌液。再經(jīng) His-Bind樹脂柱純化復性的 scFv，SDS-PAGE顯示純化效果較好（圖9）。

圖9 scFv過His-Bind柱純化效果

2.5.2 直接競爭ELISA 在聚苯乙烯酶標板上包被純化抗體（1μg/well），室溫下孵育過夜，洗滌后，加入不同稀釋度西維因標樣和相同稀釋度酶標抗原（各100μg/well），室溫下反應(yīng)1h，洗滌后，添加150μL底物液，室溫下顯色20min，再添加50μL終止液，終止反應(yīng)。在雙波長方式（450/650nm）下用酶標儀讀取OD值（圖10）。

圖10 西維因直接競爭ELISA鑒定結(jié)果

ELISA檢測結(jié)果顯示，吸光值隨標品加入量的增加而降低，純化后的scFv蛋白可以與其相應(yīng)的抗原特異性結(jié)合。

3 討論

包涵體復性的方法很多，目前常用的復性方法主要有稀釋復性、透析復性和層析復性，而其中透析復性是實驗室最常用的復性方法。由于影響蛋白復性的因素很多，如氧化還原體系、表達蛋白的濃度、復性的時間以及復性的溫度等，不同的蛋白其復性條件需要具體摸索。本實驗采用透析復性方法，將復性蛋白濃度調(diào)至200μg/mL，有效避免了鏈間二硫鍵的產(chǎn)生，同時在復性緩沖液中加入L-Arg，可非特異性結(jié)合于錯配二硫鍵和不正確折疊結(jié)構(gòu)，降低其穩(wěn)定性，并使之逐漸轉(zhuǎn)變成正確折疊。實驗對scFvpET30a（+）蛋白復性條件的確定只是初步的，對于如何大量獲得高純度有活性的目的蛋白，還有待于進一步摸索更為有效的復性方法［8-10］。

由于單鏈抗體是單價抗體，只有一個抗原結(jié)合位點，其穩(wěn)定性和親和力都較天然抗體低，并且只能與一種抗原特異性結(jié)合，功能單一，為此可將單鏈抗體進行進一步改造，以提高其活性和功能。例如將scFv中二個可變區(qū)之間的接頭縮短，迫使二個分子間的VL和VH配對形成雙價抗體，其結(jié)合性能優(yōu)于單價分子。如果將兩種不同特異性的可變區(qū)基因交叉配對，則可得到雙特異抗體［11-13］。

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Cloning，expression and activity analysis of single chain variable fragment（scFv）against carbaryl

WANG Jun-ping，ZHANG Wei-wei，DU Xin-jun，WU Yi-na，DONG Feng，WANG Shuo*
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Variable regions of ligh（t324bp）chains（VL）and heavy（360bp）chains（VH）of antibody genes were cloned from hybridoma that secreting specific antibody against carbaryl using generate primers.The VLand VHwere cloned into pGEM-T-Easy and sequenced.Specific primers synthesized based on the sequenced fragments were used to amplify single chain variable fragment（scFv）which was composed of 729bp.The scFv was subcloned into pET30a（+）and transformed into E.coli BL21（DE3）for recombinant expression.Polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）results indicated that the recombinant expressed scFv formed inclusion bodies and the molecular weight was about 33kDa.Different renaturation conditions were selected to obtain more soluble proteins and the results demonstrated that 48h，200μg/mL initiative protein concentration and renaturation reagent containing arginine were the optimal conditions for renaturation.His-Bind resin was used to purify scFv.The purified recombinant antibodies presented good affinity and specificity base on competitive ELlSA.

carbaryl；scFv；cloning；expression；activity

Q789

A

1002-0306（2010）11-0161-04

2009-11-04 *通訊聯(lián)系人

王俊平（1969-），男，副教授，博士，研究方向：食品安全管理與風險評估。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（2006AA10Z448）；國家自然科學基金（20905058）。