冷凍對甲殼素固體結構的影響

劉廷國，宋 雪，李 斌，*，陸志敏

（1.華中農業大學食品科技學院，湖北武漢430070；2.池州學院化學與食品科學系，安徽池州247100）

冷凍對甲殼素固體結構的影響

劉廷國1，2，宋 雪1，李 斌1，*，陸志敏2

（1.華中農業大學食品科技學院，湖北武漢430070；2.池州學院化學與食品科學系，安徽池州247100）

甲殼素和質量濃度45%的NaOH溶液按料液比1∶10充分混勻，分別在-18℃和-35℃下冷凍處理，研究堿-冷凍處理對甲殼素凝聚態結構的影響。采用酸堿滴定法測定樣品的脫乙酰度，X-射線衍射、紅外光譜和差示掃描量熱分析研究經冷凍后樣品聚集態結構的變化情況。結構分析結果表明，慢速冷凍過程中，冰晶的形成和生長能夠破壞分子內/分子間氫鍵相互作用，使有序的分子結構紊亂，破壞致密的晶體結構，使甲殼素結晶度下降。但是這種結晶結構的破壞作用是不穩定的、可逆的。盡管如此，堿-冷凍處理仍可以作為一種有效的甲殼素化學修飾前處理手段，能夠明顯加快反應速率而不影響甲殼素分子鏈主體結構。

甲殼素，冷凍，非均相，凝聚態結構

甲殼素是由2-乙酰氨基-2-脫氧-D-吡喃葡萄糖通過β-1，4糖苷鍵縮合而成的線性同聚多糖，主要是由海產品蝦和蟹加工后的廢棄物——蝦頭和蟹殼經過稀酸脫鈣和稀堿脫除蛋白質后制成的高附加值天然多糖［1］。它是自然界中迄今為止所發現的唯一具有明顯堿性、帶有正電荷、產量僅次于纖維素的天然多糖，也是除蛋白質外含氮量最高的可再生天然有機化合物，估計每年自然界生物合成的甲殼素將近100億t［2-3］。甲殼素及其衍生物具有優良的透氣性、成膜性、成纖維性、吸濕性、生物降解性、生物相容性、廣譜抗菌性及重金屬離子螯合性等［4-5］，在紡織、印染、造紙、醫藥、食品、化工、環保、生物工程、農業等諸多領域顯示出其獨特的應用價值，市場發展前景樂觀［6-7］。但甲殼素不溶于一般溶劑，濃酸雖可使其溶解，但對分子鏈降解嚴重［8］。分子鏈上存在大量化學反應惰性的乙酰氨基，強化了甲殼素分子致密的晶體結構，增大了對甲殼素直接進行化學修飾的難度。破壞甲殼素結晶結構、提高溶解性和化學反應活性成為近年科學家廣泛關注的熱點研究問題之一［9-10］。化學修飾［11］、高能射線輻射［12-13］、超聲波［14］、冷凍［15-16］以及超微粉碎［17］等眾多方法被用來破壞甲殼素致密的晶體結構，提高其溶解性或化學反應活性。其中，冷凍法因其安全、高效、對甲殼素分子鏈主體結構損傷小而被廣泛應用。科學家已經注意到在冷凍過程中，冰晶體的存在和生長，會不同程度地對碳水化合物高聚物微觀結構造成機械損傷，進而破壞其晶體結構［16，18-19］。目前對甲殼素冷凍處理的研究報道較少且不系統，國內尚無該方面文獻報道，本研究著重探討了緩慢凍結和快速凍結對甲殼素凝聚態結構的影響，以期為冷凍法在碳水化合物研究中的擴大應用積累理論和實踐經驗，也為甲殼素的深加工提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲殼素 食品級，脫乙酰度21.11%，粒度60～80目，浙江金殼生物化學有限公司；除特別說明外，實驗用水均為雙蒸水，所用化學試劑均為分析純。

循環水式多用真空泵（SHB-III） 鄭州長城科工貿有限公司；冷凍離心機（TGL-16C） 珠海云天環保科技有限公司；真空干燥箱（DZF-6050） 上海精宏實驗設備有限公司；X-射線衍射儀（D/Max-IIIA）日本Rigaku公司；紅外光譜儀（NEXUS 470 FT-IR）美國Nicolet公司；差示掃描量熱儀（204-F1） 德國Netzsch公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 堿甲殼素冷凍處理 一定質量的甲殼素粉末與質量濃度為45%的NaOH溶液按料液比1∶10（W∶V）充分混合均勻，室溫靜置8h后真空脫氣30min，使甲殼素顆粒充分浸潤，密封后分別置于-18℃和-35℃下冷凍1～5d。處理結束后，樣品取出經自然解凍后觀察樣品溶解情況，樣品于4℃、4000r/min離心20min，沉淀用70%（V/V）乙醇洗滌至用0.1mol/L AgNO3檢測無Cl-殘留為止，再分別用95%乙醇、無水乙醇脫水，60℃真空干燥24h，取出研磨置干燥器備用。

1.2.2 測試方法

1.2.2.1 理化指標 溶解性的測定采用目測法，0.20g干燥的甲殼素樣品分散于20mL 0.1mol/L鹽酸溶液中，25℃磁力攪拌4h，觀察樣品溶解情況。樣品脫乙酰度（Degree of Deacetylation，DDA，%）采用改進的堿量法測定［20］。

1.2.2.2 結構表征 粉末 X-射線衍射（X-Ray Diffraction，XRD）圖譜由X-射線光譜儀獲得，測定條件為20℃，35kV，30mA，石墨單色器，DS/SS=1°，RS =0.3mm，采用Cu Kα1輻射λ=1.54184?。掃描角度（2Theta，2θ，°）范圍為4～60°，步進0.02°，每分鐘4°，結晶度由（110）晶面的結晶指數（Crystallinity Index，CrI110，%）表示，計算公式如下：CrI110=（I110-Iam）× 100/I110（式中I110指2θ為20°左右最強衍射峰的相對強度，Iam指2θ為16°處的無定形漫散射峰的相對強度）［21］，數據的分析處理采用MDI Jade軟件包（Jade 5.0，Materials Data Inc，Japan）實現。

傅立葉變換紅外光譜（FT-IR）由FT-IR光譜儀在室溫、干燥條件下掃描獲得，掃描范圍為4000～400cm-1，分辨率4cm-1，累加32次，以空氣為背景，每個樣品掃描前扣除背景［20，22］，所有數據的采集和處理采用儀器自帶的OMNIC分析軟件包分析獲得。

差示掃描量熱（Differential Scanning Calorimetry，DSC）儀研究樣品熱特性，純金屬銦（99.99%）校正儀器的溫度和熱焓，準確稱取5.0±0.1mg樣品放入蓋子中心帶孔的鋁坩堝中，密封，用相同的空坩堝作參比，以20℃·min-1升溫速率從30℃升至190℃，恒溫5min。快速冷卻后重新稱重，再以10℃·min-1從30℃加熱到500℃，整個過程均在干燥N2下進行，吹掃氣流量20mL·min-1，保護氣流量60mL·min-1，數據的采集和分析利用儀器自帶的Proteus軟件包實現［23-24］。

2 結果與討論

表1 -18/-35℃堿冷凍處理對甲殼素脫乙酰反應的影響

2.1 堿-冷凍處理對甲殼素理化性質的影響

甲殼素非均相脫乙酰反應可視為典型的液固復相反應，遵循復相反應規律。探討了甲殼素濃堿混合物經不同凍結溫度冷凍處理后對甲殼素脫乙酰反應的影響，通過測定樣品的脫乙酰度間接監測脫乙酰反應進程。常規家用冰箱冷凍室溫度為-18℃，而常規大型冷庫溫度為-35℃，碳水化合物冷凍加工的已有研究表明，溫度高于-18～-23℃的凍結屬慢速凍結，低于-30℃屬快速凍結，在慢速凍結過程中，冰結晶首先出現在樣品顆粒間隙，且分布不均勻，對樣品結構的損傷較大；反之，在快速凍結過程中，冰結晶即可均勻地分布在樣品顆粒間隙中并形成小的針狀冰結晶，對結構的損傷較小。結合工業生產實際和濃堿溶液的性質本研究選擇-18℃和-35℃分別作為冷凍處理溫度。

在兩種不同溫度下冷凍處理的樣品，冷凍結束后經解凍均未觀測到樣品有溶解現象，而文獻［20］報道，采用低溫冷凍-解凍的溫度循環處理可以使甲殼素溶解于10%NaOH溶液中，從而獲得一種甲殼素均相溶液。經堿-冷凍處理的甲殼素樣品分散于一定量0.1mol/L HCl溶液中，攪拌一定時間，亦未觀測到溶解現象，-18℃處理樣品有輕微溶脹現象，而-35℃處理樣品未有明顯溶脹現象發生。表1反映了堿-冷凍處理對甲殼素脫乙酰反應的影響。由表可知，經過5d的冷凍處理，甲殼素樣品間脫乙酰度無顯著差異，與原料甲殼素相比亦無顯著差異。以上現象說明，冷凍過程中冰晶的形成和生長強制NaOH分子滲透進甲殼素顆粒內部，打開分子間或分子內部分氫鍵相互作用，破壞甲殼素致密的晶體結構，但是對甲殼素分子鏈的破壞較少，能夠較好地保持甲殼素分子結構的完整性，為利用甲殼素為原料進行進一步化學修飾提供了可能。

2.2 堿-冷凍處理對甲殼素凝聚態結構的影響

2.2.1 XRD分析 圖 1給出了純化甲殼素和經-18℃冷凍處理樣品的XRD圖譜。純甲殼素在2θ為9.44、19.28、20.80、23.70和26.40°有5個尖銳的衍射峰，分別對應于（020）、（110）、（120）、（101）和（130）晶面，屬正交晶系，符合α-甲殼素的衍射特征。經冷凍處理，這5個清晰衍射峰強度明顯減弱或被掩蓋。特別是對應于（120）和（101）晶面的衍射峰幾乎完全被掩蓋。由圖可知，冷凍處理1d的樣品19.28°處衍射峰強度急劇下降為甲殼素的35%，隨后下降緩慢，第2d達到最低值34.62%，隨著處理時間的延長，又開始緩慢回升，冷凍5d樣品衍射峰強度又恢復到原料甲殼素的59.43%。冷凍處理1d樣品的CrI110由原料的99.15%下降到83.16%，2d樣品CrI110降至最低值為 82.30%，處理 5d后回升至96.05%，說明冷凍2d即可較大限度破壞甲殼素晶體結構，作為甲殼素化學修飾前處理手段是比較合適的，單純通過增加冷凍處理時間并不能進一步破壞甲殼素凝聚態結構。

圖1 -18℃冷凍處理樣品的XRD圖譜

值得注意的是，文獻報道（020）晶面衍射峰強度隨脫乙酰度的增加而降低，結晶度也隨之降低［25］。而從圖1可以看出，與甲殼素相比，該晶面衍射強度確有降低，但在處理達到2d以后，衍射峰的強度反而上升，不過該晶面的面間距由未處理的9.3685?增大到2d的9.9580?，然后維持在9.7171?左右，這進一步證明了冷凍可以降低甲殼素分子結構的規整性，使其分子間排列松散，結晶度降低，有利于進一步處理。之所以產生與上述文獻的差異，可能是在此脫乙酰度差別不大（表1）的前提下，脫乙酰度變化對結晶區的影響，尚不及冷凍產生的影響。

圖2給出了分別在-18℃和-35℃冷凍1、2、5d樣品的XRD圖譜，由圖可見，-35℃處理樣品，在1～5d冷凍中衍射峰強度幾乎無差異。而在-18℃處理1d和2d的樣品，卻比-35℃處理的樣品衍射峰強度明顯低得多，說明-18℃左右的溫度處理最適合破壞甲殼素分子間相互作用力，更低的溫度反而不利于這種作用。其主要原因是-18℃更接近甲殼素堿混合物的凍結點溫度（不能簡單理解為冰點溫度），在此溫度下，冰晶中小分子的運動性顯然強于-35℃下，冰晶的晶粒亦大于后者，因此可以更加有效地破壞甲殼素晶體結構。而-35℃冷凍時，體系完全處于玻璃態下，分子運動性大大減弱，形成的冰晶晶粒細小、分布均勻，對甲殼素結構的破壞作用比較有限。這實際上與碳水化合物冷凍加工中的許多現象是吻合的。

圖2 -35℃與-18℃冷凍處理樣品的對比XRD圖譜

-18℃處理更長時間后，已被強制疏松排列的運動性較強的甲殼素分子，并不能處于穩態，需要重新進行自組裝，比如以熵增的方式，回到低能態，此時為適應新的環境相態，部分微晶結構可能稍有差異，但結晶度提高，圖2處理5d的樣品與-35℃樣品的衍射譜線幾乎重合即說明這一問題。

2.2.2 FT-IR分析 紅外光譜是研究有機物氫鍵相互作用的一種較為有效的常規手段之一。圖3和圖4分別給出了冷凍處理溫度為-18℃和-35℃樣品的紅外光譜圖。對比甲殼素的FT-IR光譜圖［20］，對于-18℃冷凍處理樣品，甲殼素3448cm-1處的O-H伸縮振動吸收峰變寬并向低波數方向移動，處理1d樣品最為明顯，移動了14cm-1，這是典型的分子間氫鍵作用減弱的標志，然而，隨處理時間的延長又緩慢恢復，5d時重新回到3448cm-1，這與XRD分析的結果是一致的。

圖3 -18℃冷凍處理樣品的FT-IR圖譜

圖4 -35℃冷凍處理樣品的FT-IR圖譜

-35℃處理樣品在該O-H伸縮振動及氫鍵作用區域，變化明顯不及-18℃處理樣品，除了4d樣品向低波數方向移動了17cm-1外，其它樣品偏移量很小，僅1～7、3274、3103cm-1處分別反映N-H伸縮振動的吸收峰和C（21）NH…O=C（73）和C（61）OH…HOC（62）分子內氫鍵［20］，與原料甲殼素相比均明顯減弱，-18℃和-35℃樣品差別并不顯著，這亦與XRD分析結果相吻合。

2.2.3 DSC分析 對原料與樣品進行差示掃描量熱分析，從熱力學角度分析處理前后甲殼素凝聚態結構的差異，-18℃和-35℃處理樣品DSC圖譜和一階微分DSC圖譜與甲殼素和殼聚糖原樣相比明顯不同，所有樣品的熱分解參數列于表2中。經過冷凍處理的所有樣品DSC圖譜，觀測到兩個明顯的熱行為，第一個是分別以293.2℃和296.0℃為中心的放熱峰，歸因于甲殼素分子的重結晶；第二個是分別以343.3℃和337.6℃為中心的吸熱峰，歸因于甲殼素的熱分解，這與甲殼素原粉的熱特性極為相似，但分解溫度提前了50℃左右。說明經過堿-冷凍處理使甲殼素致密的氫鍵網絡結構破壞或減弱，導致分子柔性增加，分子運動性、擴散性增強，穩定性變差，分解溫度提前。

表2 -18/-35℃堿冷凍處理對甲殼素熱分析特性的影響

文獻報道甲殼素和殼聚糖的玻璃化轉變溫度（Glass Transition Temperature，Tg）分別為236℃［26］和203℃［27］。從表2數據可以看出，樣品經過冷凍處理后玻璃化轉變溫度急劇降低，這也有力地說明了樣品經過冷凍處理后，分子的運動性大大提高。然而各組樣品自身之間Tg變化并不顯著，特別是經過-35℃處理樣品的Tg降低的更多，但重結晶峰溫度變化卻不及-18℃處理樣品劇烈，說明-35℃處理的樣品比-18℃處理樣品處于更不穩定的亞穩態，這與XRD、FT-IR的分析結果相吻合。

綜上所述，冷凍處理樣品的熱特性顯然不同于甲殼素，重結晶峰的出現，說明經冷凍誘導的甲殼素結晶破壞作用并不是十分徹底，而且這種破壞作用是可逆的，經過加熱后又可以重新形成結晶。然而，即使如此，冷凍處理還是可以顯著降低甲殼素分子致密的晶體結構，使其穩定性降低、分解溫度提前。

3 結論

探討了堿液冷凍處理對甲殼素凝聚態結構的影響，冷凍處理過程中形成的冰晶能夠顯著破壞甲殼素分子內、分子間氫鍵相互作用，破壞甲殼素高度規整的分子結構，使其結晶度下降，有利于進一步結構修飾。慢速冷凍過程較快速冷凍的破壞作用更為顯著，兩者均能迫使甲殼素分子由穩態趨向于亞穩態。結構分析及理化分析結果表明，冷凍處理只破壞甲殼素結晶結構，對分子鏈骨架結構不造成損傷，有利于保持甲殼素固有的生物活性。冷凍導致結晶度降低的程度有限，最初2d處理時迅速下降，其后逐漸回升，且這種由冷凍誘導的結晶破壞作用部分可逆，經過加熱處理后又會重新形成分子間氫鍵，產生新的微晶，使結晶度提高。但可以肯定的是，冷凍處理可以作為一種有效、可控的甲殼素化學修飾前處理手段，以提高反應活性。

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Effect of alkali-freezing treatment on the solid state structure of chitin

LIU Ting-guo1，2，SONG Xue1，LI Bin1，*，LU Zhi-min2
（1.College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China；2.Department of Chemistry and Food Science，Chizhou College，Chizhou 247100，China）

The effects of alkali-freezing treatment on the condensed state structure of chitin were explored.Chitin powder was soaked in concentrated sodium hydroxide（with a mass concentration of 45%，and the ratio of chitin and NaOH solution was 1∶10，W/V）and freezed at-18℃ and-35℃ for further modification.The degree of deacetylation（DDA）was determined by acid-base titration method.X-ray diffraction（XRD），infrared spectroscopy（lR）and differential scanning calorimetry（DSC）measurements were employed to investigate the condensed state structural changes of the freezing-treated chitin powders.Structural analysis results showed that the formation and growth of ice crystal during the slowly freezing process that can break the intra-and/or inter-molecular hydrogen bonds interaction，disorder the ordered molecular structure and destruct the compact crystal structure and decline the crystallinity of chitin.The study explained that the alkali-freezing treatment was beneficial for further modification of chitin，which can increase the chemical reaction rate and keep the main molecular chain structure of chitin completely.

chitin；freezing；heterogeneous；condensed state structure

TS254.9

A

1002-0306（2010）11-0094-05

2009-11-04 *通訊聯系人

劉廷國（1982-），男，碩士，講師，研究方向：農副產品深加工與應用。

國家“863”資助項目（2007AA10Z310）；池州學院化學材料與工程省級實驗中心建設項目。