向日葵黃色素抗氧化活性及清除自由基活性能力的初探

叢建民，陳鳳清，江海龍，劉 艷，沈海龍，*

（1.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040；2.白城師范學(xué)院，吉林白城137000）

向日葵黃色素抗氧化活性及清除自由基活性能力的初探

叢建民1，2，陳鳳清2，江海龍2，劉 艷1，沈海龍1，*

（1.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040；2.白城師范學(xué)院，吉林白城137000）

本文從向日葵花中提取黃色素，研究其抗氧化活性。結(jié)果表明，向日葵黃色素對DPPH、超氧陰離子自由基（·）、羥自由基（·OH）、過氧化氫（H2O2）都具有較強清除作用，并且隨加入量的增加而增大。說明向日葵花黃色素是一種很有開發(fā)前景的抗氧化劑，具有很高的利用價值。

向日葵花黃色素，DPPH，超氧陰離子自由基，羥自由基，過氧化氫，抗氧化

在生物機體的生命活動中，新陳代謝過程中不斷發(fā)生著氧化和還原反應(yīng)，氧化代謝會不斷產(chǎn)生各種自由基。自由基性質(zhì)活潑，有極強的氧化反應(yīng)能力，對人體有很大的危害性。體內(nèi)自由基和脂質(zhì)過氧化作用使各種大分子成分如核酸、蛋白質(zhì)發(fā)生氧化變性，DNA交聯(lián)和斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變和功能破壞，而引起癌癥、衰老及心血管等疾?。?］。食品的色澤是衡量食品質(zhì)量的主要指標(biāo)之一，在食品中添加色素，不但能保證產(chǎn)品色澤均勻性，而且還能改進(jìn)產(chǎn)品的外觀。天然色素在食品上的應(yīng)用成了近年來新興的科學(xué)研究領(lǐng)域［2-5］。從農(nóng)作物和果蔬中提取的天然色素，其色澤自然、安全、無毒副作用，具有較高的營養(yǎng)。植物色素中存在多種生物活性物質(zhì)如花色苷類、多酚類、黃酮類等，具有清除自由基等抗氧化活性，這些功能對抗癌、防癌、抗衰老、預(yù)防心血管疾病、提高身體健康有促進(jìn)作用［6］。本文從向日葵花瓣中提取的黃色素含有黃酮類物質(zhì)和類胡蘿卜素類物質(zhì)，而這二類物質(zhì)均具有良好的抗氧化活性功能，而且均是通過清除自由基達(dá)到抗氧化效果的。因此為了考察向日葵花黃色素的功能特性，采用FRAP法和DPPH法、鄰苯三酚自氧化法、鄰二氮菲-Fe2+氧化法、魯米諾化學(xué)發(fā)光法初步探討向日葵花黃色素的抗氧活性及清除自由基能力，為開發(fā)向日葵花黃色素提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

向日葵花瓣 2007年8月采摘于白城師范學(xué)院校園內(nèi)，陰干，粉碎后過40目篩，樣品作為實驗樣品。按料液比1∶40（g/mL）加入70%（v/v）的乙醇溶液中，50℃恒溫浸提3h后離心，上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓蒸餾，濃縮液凍干后得粉末；FeCl3、FeSO4、HCl、VC、H2O2、苯甲酸、醋酸、醋酸鈉、無水乙醇、95%乙醇、羅丹明B、三羥甲基氨基甲烷、二丁基羥基甲苯（BHT） 均為國產(chǎn)分析純試劑；魯米諾、鄰苯三酚、三吡啶三亞吖嗪、tripyridyltriazine（TPTZ）、l，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH） Sigma公司。

RF-5301PC熒光分光光度計 日本島津；BS200s電子分析天平，UV-1700紫外-可見分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 色素總抗氧化能力的測定 采用FRAP法［7-8］。

Fe3+-三吡啶三吖嗪（TPTZ）可被試樣中還原物質(zhì)還原為Fe2+形式，呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色，并于593nm處具有最大光吸收，根據(jù)吸光度的大小計算樣品抗氧化活性的強弱。

測定方法：分別配制0.10g/L的各種色素以及VC溶液作為樣品，按0.1mL樣品+0.3mL水+3mL FRAP工作液比例混合，搖勻后37℃下加熱4min，于593nm測其吸光值；另以 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L FeSO4的標(biāo)準(zhǔn)溶液代替樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出直線回歸方程，進(jìn)而計算出樣品的總抗氧化能力，以毫摩爾 FeSO4/g提取物表示，單位為mmol/g。

FRAP工作液為 10mmol/LTPTZ+20mmol/L FeCl3+0.3mmol/L醋酸鈉緩沖液 1∶1∶10的混合物。

1.2.2 DPPH自由基清除能力的測定 DPPH是一種穩(wěn)定的有機自由基，其乙醇溶液呈紫色，在可見光區(qū)最大吸收波長為517nm。當(dāng)DPPH溶液中加入自由基清除劑時［9-12］，溶液顏色變淺，A517nm值變小，而且吸光度變小的程度與自由基被清除的程度呈線性關(guān)系，因此可用自由基的清除情況來評價某物質(zhì)的抗氧化能力，其抗氧化能力用抑制率來表示，抑制率越大，抗氧化能力越強。

先用無水乙醇配制2×10-4mol/L的DPPH溶液，同時分別稱取一定量的各種固體色素及VC用蒸餾水溶解，并將其稀釋為以下濃度：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05g/L，作為測定液。取測定液2mL及DPPH溶液2mL加入同一具塞試管中，搖勻，30min后用無水乙醇作參比測定其吸光度Ai，同時測定2mL DPPH溶液與2mL無水乙醇混合液的吸光度Ac，以及2mL測定液與2mL無水乙醇混合液的吸光度Aj，根據(jù)下式計算測定液對DPPH的清除率。按以上測定方法分別測定其清除率，得出直線回歸方程，進(jìn)而計算其50%清除率（IC50）。

式中：Ac為未加測定液時DPPH的吸光度；Aj為測定液在測定波長吸光度；Ai為加測定液后DPPH的吸光度。

分別配置不同濃度的色素樣品，以VC為參照，按上述方法測定不同濃度的樣品對超氧陰離子自由基（·）的清除率。

1.2.4 羥自由基（·OH）的清除能力的測定 采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法［14］：在試管中依次加入5mmol/L鄰二氮菲0.6mL，pH7.4的磷酸鹽緩沖液0.4mL和5mmol/L Fe2+-EDTA（體積比為1∶1.5）0.6mL；其中加入體積分?jǐn)?shù)為0.1%H2O20.8mL作為損傷管，加入體積分?jǐn)?shù)為0.1%H2O20.8mL和lmL樣品的作為樣品管，不加H2O2和樣品的作為空白管；將各管用無水乙醇定容到4mL，37℃下反應(yīng)1h，536nm波長下比色。按下公式計算清除率：

分別配制不同濃度的色素樣品，以VC為參照，按上述方法測定不同濃度的樣品對輕自由基（·OH）的清除率。

1.2.5 過氧化氫（H2O2）清除能力測定 采用魯米諾化學(xué)發(fā)光法［15］：向反應(yīng)池中加入50μL供試液，50μL 1mmol/L魯米諾溶液，放入反應(yīng)池中。100μL pH9.5碳酸緩沖液，搖勻后加體積分?jǐn)?shù)0.15%H2O250μL，啟動發(fā)光反應(yīng)，連續(xù)測定反應(yīng)強度6s，至出現(xiàn)峰值，記錄發(fā)光強度（C1），繪制清除率與樣品濃度曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 向日葵花黃色素、VC、BHT的抗氧化活性比較

表2采用FRAP法測定結(jié)果表明，向日葵黃色素具有一定的抗氧化活性，其總的抗氧化活性相當(dāng)于食品中常用的抗氧化劑BHT的總抗氧化活性45%以上，相當(dāng)于VC總抗氧化活性的52%以上。

表1 各樣品的測定結(jié)果（±s，n=5）

表1 各樣品的測定結(jié)果（±s，n=5）

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表2 向日葵花黃色素、VC、BHT的抗氧化活性比較（mmol/100mg）

2.2 向日葵花黃色素對DPPH·的清除效果

圖1 向日葵黃色素、VC對DPPH·的清除效果

由圖1可見，向日葵黃色素與VC對DPPH·的清除效果均隨其質(zhì)量濃度的增大而增大，當(dāng)濃度高于0.5mg/mL時，濃度的改變對其清除率的影響較小，在低濃度時，色素與VC的效果相當(dāng)，在0.2mg/mL以上濃度，色素的清除效果高于VC。

2.3 向日葵花黃色素對超氧陰離子的清除效果

從圖2數(shù)據(jù)分析可知，向日葵黃色素和對照物VC對超氧陰離子自由基（·）有極強的清除作用，且清除能力與濃度有明顯的量效關(guān)系。從圖中可以看出，同為0.1mg/mL的向日葵花黃色素對超氧陰離子自由基（·）的清除作用明顯優(yōu)于等濃度的VC。

圖2 向日葵黃色素、VC對超氧陰離子自由基（·）的清除效果

2.4 向日葵花黃色素對羥自由基（·OH）清除效果

向日葵花黃色素和VC對羥自由基（·OH）清除率的測定結(jié)果見圖3。由數(shù)據(jù)可知，向日葵黃色素對羥自由基（·OH）表現(xiàn)出顯著的清除效果，其清除能力強于VC，且隨著色素濃度的升高，清除率也隨之增加，量效顯著。

圖3 向日葵黃色素、VC對羥自由基（·OH）的清除效果

2.5 向日葵花黃色素對H2O2的清除效果

由圖4可見，對照物VC與向日葵黃色素的清除率均隨質(zhì)量濃度的增加明顯增大，說明向日葵黃色素具有清除H2O2的作用，與VC的清除效果相當(dāng)。

圖4 向日葵黃色素、VC對H2O2的清除效果

3 結(jié)論

向日葵花黃色素具有抗氧化活性，同時對DPPH·、超氧陰離子自由基（·）、羥自由基（·OH）、過氧化氫（H2O2）都具有較強清除作用，并且隨加入量的增加而增大。同時說明向日葵花黃色素是一種很有開發(fā)前景的抗氧化劑，具有很高的利用價值，既可以用作食品著色添加劑開發(fā)，也可以用于天然藥物的研制，有關(guān)其在人體內(nèi)的抗氧化作用及其色素中的花色苷、黃酮等的種類、含量、結(jié)構(gòu)等有待于進(jìn)一步研究。

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Study on Helianthus yellow pigment antioxidant activity and free radical scavenging capacity

CONG Jian-min1，2，CHEN Feng-qing2，JIANG Hai-long2，LIU Yan1，SHEN Hai-long1，*
（1.Northeast Forestry University，Haerbin 150040，China；2.Baicheng Normal College，Baicheng 137000，China）

Antioxidant activity of Helianthus yellow pigment extract was studied.The results showed that the Helianthus yellow pigment had strong scavenging effect to DPPH，superoxide anion（·），hydroxyl radical（·OH）and hydrogen peroxide（H2O2），the scavenging effect increased according to the increase of adding amount.Helianthus yellow pigment has high value with promising development prospects.

Helianthusyellow pigment；DPPH；superoxide anion；hydroxylradical；hydrogen peroxide；antioxidant activity

TS201.1

A

1002-0306（2010）11-0315-03

2009-07-02

叢建民（1974-），講師，主要從事生物化學(xué)、分子生物學(xué)研究工作。

吉林省中醫(yī)藥管理局資助項目（ZY31）；白城市科技局資助項目（20070403）。