青霉素?；钢苽涔鈱W純β-苯丙氫酸的HPLC分析

李登超

(淮陰師范學院生命科學學院,江蘇淮安 223300)

青霉素?；钢苽涔鈱W純β-苯丙氫酸的HPLC分析

李登超

(淮陰師范學院生命科學學院,江蘇淮安 223300)

建立了青霉素?；钢苽涔鈱W純β-苯丙氨酸(BPA)過程中各成分的 HPLC分析方法。用 Zorbax XDB-C18柱在流動相為含 35%(v/v)乙腈的 7mmol/L pH 3.0磷酸緩沖液(含 SDS 0.68g/L),流速為 1.0mL/min,柱溫 30℃,檢測波長為 210nm等條件下,四種物質苯乙酰胺、BPA、N-苯乙酰-BPA、苯乙酸可以被有效分離,且在≤0.2mg/mL濃度下,四種物質含量與出峰面積均呈良好的線性相關。用 Chirobiotic T和 Chirobiotic R手性柱分別對手性物質N-苯乙酰-BPA和BPA的對映異構體進行了分離檢測,并確定了最佳的洗脫條件。

青霉素?；?β-苯丙氨酸,光學純,高效液相色譜法

光學純β-苯丙氨酸 (BPA),具有重要的生物和醫學用途,如酶抑制劑[1]和β-抗生素[2],抗癌藥物紫杉醇的側鏈是羥基化的 BPA,側鏈對紫杉醇發揮抗癌作用是不可缺少的[3]。近年來,用生物法制備光學純BPA及其衍生物的研究備受青睞。青霉素?；?PGA,EC.3.5.1.11)是在青霉素 G鉀鹽裂解成 6-氨基青霉烷酸(6-APA)和側鏈羧酸過程中起關鍵作用的酶,在醫藥工業廣泛應用其水解酶特性生產6-APA[4],而且 PGA還具有酰化酶的特性[5-8]。我們在利用 PGA?；柑匦圆鸱滞庀鼴PA時,發現PGA能專一性地酰化一種對映體,另一對映體形式不被酰化,通過進一步分離純化得到兩種不同光學活性的BPA[9]。但在酰化反應過程中涉及到四種物質,即兩種底物BPA和苯乙酰胺,兩種產物 N-苯乙酰-BPA和苯乙酸。由于四種物質都具有苯環結構,在紫外區都有光吸收,而且苯乙酰胺和BPA都含有-NH2,因此,很難用常規的顯色方法來定量檢測其中任何一種物質的含量,進而影響到對反應過程的分析。另外,BPA和N-苯乙酰-BPA都是手性物質,具有對映異構體,所以建立分離兩種物質對映異構體的方法對定量調控反應過程和分析產物的光學純度顯得尤為重要。因此,本文嘗試利用高靈敏度的HPLC對其進行分離檢測,建立 HPLC分析方法,以期為相關領域的研究提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

BPA標準品 Sigma公司;BPA、N-苯乙酰-BPA實驗室自行合成,經色譜鑒定其純度分別大于99%和 98%;其他試劑 均為市售分析純。

Zorbax XDB-C18柱 4.6mm ×250mm,5μm, Agilent;Chirobiotic T手性柱 4.6mm×250mm,5μm, ASTEC;Chirobiotic R手性柱 4.6mm×150mm,5μm, ASTEC;0.45μm水相和有機過濾膜 上海源聚生物科技有限公司;1100series高效液相色譜儀Agilent;THX-05溫度控制儀,XT4A顯微熔點儀, WZZ-1S自動旋光儀等。

1.2 實驗方法

1.2.1 四種物質的分離檢測 反應過程反應液中各組成的含量分析通過裝有 XDB-C18柱的Agilent 1100系列HPLC液相色譜系統。流動相為含35%(v/v)乙腈的 7mmol/L pH 3.0磷酸緩沖液 (含 SDS 0.68g/L),流速為 1.0mL/min,柱溫 30℃,檢測波長為 210nm。

1.2.2 標準曲線繪制 準確配制 2mg/mL的 BPA、N-苯乙酰-BPA、苯乙酸和苯乙酰胺母液,分別取 0、0.1,0.2、0.3、0.4、0.5、1mL母液于 10mL容量瓶中,用雙蒸水定容,微膜過濾。上樣量 10μL,用 XDB-C18柱按照上述方法進行 HPLC分析檢測,以峰面積為縱坐標,以四種物質的濃度為橫坐標,分別制定了標準曲線,在 0.2mg/mL濃度以下,四種物質的峰面積與濃度成很好的線性相關(圖 1)。

圖 1 HPLC測定四種物質的標準曲線圖

1.2.3 N-苯乙酰-β-苯丙氨酸的對映體含量分析通過裝有 Chirobiotic T手性柱的 Shi madzu LC-10Avp液相色譜系統。流動相為 35%乙腈和 65%20mM磷酸緩沖液(pH 5.5),流速為 1.0mL/min,柱溫 20℃,檢測波長 210nm。

1.2.4 β-苯丙氨酸的對映體含量分析 通過裝有Chirobiotic R手性柱的 Shi madzu LC-10Avp液相色譜系統。流動相為甲醇∶醋酸∶三乙胺 =100∶0.4∶0.1,流速為 0.4mL/min,柱溫 10℃,檢測波長 254nm。

2 結果與分析

2.1 XDB-C18柱檢測四種物質的圖譜

采用安捷倫 Zorbax XDB-C18柱,7mmol/L pH3.0緩沖鹽(含 0.68g/L SDS),分別用含乙腈 30%、35%、40%的流動相進行四種物質分離檢測。當流動相中的乙腈含量為 30%時,能將苯乙酰胺、苯乙酸、N-苯乙酰-BPA、BPA完全分開,出峰時間分別為 3.7、6.8、12.5、26.5min;當乙腈含量為 35%時,四種物質的出峰時間分別為 3.2、5.2、7.6、10.7min,分離度均大于1.5,都能完全分開;進一步提過乙腈含量為 40%,由于出峰時間太快,N-苯乙酰-BPA、BPA的出峰時間重疊,不能分開。因此確定流動相組成為含35%(v/v)乙腈的 7mmol/L pH 3.0磷酸緩沖液 (含SDS 0.78g/L)。典型的四種物質的 HPLC分離圖譜如圖2所示。

圖 2 XDB-C18柱分離檢測四種物質的色譜圖Ⅰ.苯乙酰胺;Ⅱ.苯乙酸;Ⅲ.N-苯乙酰-BPA;Ⅳ.BPA

2.2 Chirobio tic T手性柱分離消旋的 N-苯乙酰-β -苯丙氨酸

由表 1可知,在流動相比例為甲醇∶醋酸緩沖液=20∶80(v/v)時,分離度最高;但由于 pH偏高和流速較大等原因,S-和R-構型的N-苯乙酰-BPA出峰時間都較早。圖 3顯示了不同 pH對消旋的N-苯乙酰-BPA分離的影響,可以看出,當 pH=5.5時,色譜圖的基線平穩,峰形對稱,分離效果較好。因此確定最佳洗脫條件:甲醇∶醋酸緩沖液 (pH5.5)=20∶80 (v/v),流速 0.5mL/min,檢測波長 210nm、溫度 20℃。在此條件下兩種構型的N-苯乙酰-BPA實現了完全分離,分離度為 1.89。N-苯乙酰-(S)-BPA和N-苯乙酰-(R)-BPA的出峰時間分別為 9.4、10.7min。

表 1 不同甲醇∶醋酸緩沖液比例對消旋N-苯乙酰-BPA分離度的影響

圖 3 不同 pH對消旋N-苯乙酰-BPA分離圖譜的影響洗脫條件:甲醇∶醋酸緩沖液 =20∶80(v/v),流速 0.5mL/min,檢測波長 210nm、溫度 20℃。

2.3 Chirobio tic R手性柱分離消旋的β-苯丙氨酸

Berthod等報道[10],用手性柱 Chirobiotic T以甲醇∶水 =40∶60的流動相能將 R-和 S-BPA完全分開,分離度為 1.9,但是我們利用此類柱,按照此文獻提供的方法和檢測條件并沒有將兩種構型的 BPA分開,通過改變流動相的組成和比例,也沒有將其完全分開。后來改用 Chirobiotic R手性柱,在流動相組成為甲醇∶醋酸∶三乙胺 =100∶0.4∶0.1(by vol.),流速0.4mL/min,溫度 10℃,檢測波長 254nm的洗脫條件下,兩種對映異構體實現了基本分離,R-和 S-型BPA的出峰時間分別為 13.5、15.0min,分離度 1.44 (圖 4)。

圖 4 Chirobiotic R手性柱分離消旋的β-苯丙氨酸

3 結論

PGA在?；苽涔鈱W純BPA的反應過程中,涉及到四種物質BPA、苯乙酰胺、N-苯乙酰-BPA和苯乙酸,其中 BPA和 N-苯乙酰-BPA又各有 R-和S-兩種構型。本文建立的 HPLC方法在 12min內實現對四種物質的分離檢測;12min和 18min內實現對BPA和N-苯乙酰-BPA兩種異構體的分離檢測。在最佳洗脫條件下苯乙酰胺、苯乙酸、N-苯乙酰-BPA、BPA的出峰時間分別為 3.2、5.2、7.6、10.7min;S-和R-型N-苯乙酰 -BPA的出峰時間分別為 9.4、10.7min。R-和 S-型 BPA的出峰時間分別為 13.5、15.0min。該法可以對反應過程實時定量監控和對手性物質進行光學純度分析,從而為相關領域的研究奠定方法基礎。

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Analysis of optically pureβ-phenylalanine produced by penicillin G acylase through HPLC

L IDeng-chao
(School ofLife Sciences,Huaiyin Teacher College,Huaian 223300,China)

Feas ib le HPLC m e thods we re deve lop ed to m easure som e comp ounds in reac tion of op tica lly p ure β-p henyla lanine(BPA) p roduced by p enic illin G acylase.Foursubs tances,i.e.p henylace tam ide,BPA, N-p henylace tyl-BPA and p henylace tic ac id could be de tec ted effec tive ly us ing Zorbax XDB-C18colum n unde r the follow ing elution cond itions:m ob ile p hase was7mm ol/L p hosp hate(pH3.0),containing acetonitrile35% (v/v) and SDS0.68g/L,1mL/m in flow ra te w ith de tec tion wave leng th210nm.W hen a ll the ir concentra tions we re unde r 0.2m g/mL,contents of four subs tances had good linea r corre la tion w ith the ir own p eak a rea.Enantiom e rs of t wo chira l comp ounds,i.e.N-p henylace tyl-BPA and BPA could be de tec ted unde r the op ti m um e lution cond itions us ing Chirob iotic T and Chirob iotic R colum ns,resp ec tive ly.

p enic illin G acylase;β-p henyla lanine;op tica lly p ure;HPLC

TS207.3

A

1002-0306(2010)05-0368-03

2009-04-02

李登超 (1976-),男,講師,研究方向:生物化工。