甘木通不同部位總黃酮含量的測定

胡宗禮，黃曉萍，陳珺霞

（韶關學院英東生物工程學院，廣東 韶關 512005）

甘木通不同部位總黃酮含量的測定

胡宗禮*，黃曉萍，陳珺霞

（韶關學院英東生物工程學院，廣東 韶關 512005）

目的：建立黃酮類化合物含量的測定方法并分別測定甘木通莖、葉中總黃酮含量。方法以蘆丁為對照品建立標準曲線，以75%乙醇為溶劑在90℃加熱回流提取甘木通莖、葉中總黃酮類成分，用分光光度法在波長510nm處測定總黃酮含量。結果蘆丁濃度（C）與吸光度（A）間的關系為C＝0.090 244A－0.000 193 6（r＝1.000 0），回收率為101.18%，RSD＝2.36%（n＝5）。甘木通莖和葉中總黃酮含量分別為0.99%和1.20%。結論甘木通葉中總黃酮含量比莖約高出21%。

甘木通；總黃酮；分光光度法

甘木通Clematis filamentosa Dunn俗稱眼蛇藥，為毛茛科絲鐵線蓮屬植物，主要分布在廣東、廣西、海南、云南等地，在粵北乳源山區有較為豐富的野生資源，對心血管疾病（冠心病、高血壓）有顯著療效［1］。目前關于甘木通確切的有效成分尚不清楚，其提取物經鹽酸鎂粉反應及硝酸鋁反應均呈陽性，提示甘木通含有黃酮類成分。大量研究證實黃酮類化合物具有抗心肌缺血、降血壓、抗心律失常等功效［2］，結合甘木通及其制劑的臨床應用，甘木通中黃酮類化合物是其有效成分之一，本實驗通過對甘木通不同部位進行總黃酮含量測定，為甘木通藥用部位的選定提供依據。

1 材料

1.1 藥材與試藥

甘木通藥材（廣東雷霆國藥有限公司），采收于2007年10月，經韶關市藥品檢驗所江蘭英所長鑒定為甘木通Clematis filamentosa Dunn；蘆丁對照品（上海國藥集團化學試劑有限公司，純度為98%）；無水乙醇、石油醚、醋酸乙酯、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等均為分析純。

1.2 主要儀器

JA5033型電子分析天平（上海恒平科學儀器有限公司）；725N型紫外可見光分光光度計（上海科學精密儀器有限公司）；101-1B型電熱鼓風干燥箱（上海實驗儀器廠）；RE-52AA型旋轉蒸發器（上海雅榮生化設備儀器有限公司）。

2 方法與結果

2.1 線性考察

精密稱取120℃下干燥至恒重的蘆丁對照品15.00mg，置于100mL容量瓶中，加75%乙醇適量溶解后，加75%乙醇定容至刻度，搖勻，即得每1mL含無水蘆丁0.15mg的對照品溶液。精密量取0.0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0mL蘆丁對照品溶液，分別置于10mL容量瓶中，補充75%乙醇至5mL，搖勻；加5%亞硝酸鈉溶液0.1mL，搖勻放置6min；加入 10%硝酸鋁溶液 0.3mL，混勻放置6min；加入10%氫氧化鈉溶液4.0mL，用去離子水補加至刻度，充分搖勻，在顯色后15min以蘆丁空白為對照，于檢測波長510nm處測定吸光度值。結果采用最小二乘法，以蘆丁濃度（C）－吸光度（A）進行直線回歸，得標準曲線方程C＝0.090 244A－0.000 193 6，在蘆丁濃度為0.007 5～0.06mg·mL－1線性關系良好（r＝1.000 0）。

2.2 精密度試驗

精密量取0.5，2.0，4.0mL蘆丁對照品溶液各3份，分別置于10mL容量瓶中，按 “線性考察”項下方法測定吸光度值，代入標準曲線方程計算SD和RSD。結果用分光光度法測定不同濃度的蘆丁含量，其SD和RSD均較小，尤其是在高濃度時，說明實驗數據精確，見表1。

表1 蘆丁精密度試驗

2.3 重現性試驗

精密量取0.5，2.0，4.0mL蘆丁對照品溶液各3份，分別置于10mL容量瓶中，分3組按 “線性考察”項下方法測定吸光度值，計算SD和RSD，結果顯示重現性良好，見表2。

表2 蘆丁標準曲線的重現性試驗

2.4 穩定性試驗

精密量取0.5，2.0，4.0mL蘆丁對照品溶液和1.0mL供試品溶液各3份，分別置于10mL容量瓶中，蘆丁對照品溶液和同一供試樣品溶液在反應體系形成黃酮 －鋁鹽絡合物后0，10，20，30，40，50，60，80，100，120min，按 “線性考察”項下方法測定其吸光度。結果顯示在30min內穩定性良好，RSD＝0.12%，30min后吸光度逐漸下降且變化明顯，提示測定宜在反應顯色后30min內進行，本實驗選擇測定時間為反應顯色后15min。同時吸取同一供試品溶液1.0mL分別在制備后0，1，2，3，4，6，8h，按 “線性考察”方法測定總黃酮含量，結果RSD＝1.84%，表明供試品溶液在8h內基本穩定，測定結果無顯著變化。

2.5 加樣回收率試驗

精密量取5份已測定總黃酮含量的甘木通葉提取液供試品各1.0mL，置于10mL容量瓶中，依次加入蘆丁對照品溶液 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0mL，按 “線性考察”項下方法測定吸光度值，代入標準曲線方程計算加樣回收率與RSD，結果見表3。

表3 蘆丁加樣回收試驗

2.6 樣品含量測定

取適量甘木通莖、葉，在40℃下烘干至恒重，粉碎，分別精確稱取5.0g藥材粉末放入燒瓶中，用適量石油醚加熱回流直至無色，棄去石油醚提取液，于溫水浴中揮干殘留的石油醚，然后加100mL75%乙醇于90℃回流提取1h，過濾，殘渣加100mL75%的乙醇繼續提取3次，合并4次濾液減壓濃縮，用醋酸乙酯萃取3次，萃取液回收醋酸乙酯后轉移至100mL的容量瓶中，加75%乙醇定容即得供試品溶液。精密量取甘木通葉與莖的供試品溶液1.0mL（各3份）分別置于10mL容量瓶中，按 “線性考察”項下方法測定吸光度值，代入標準曲線方程計算葉、莖中總黃酮的平均含量，結果見表4。

表4 甘木通葉與莖的總黃酮含量

甘木通葉、莖中總黃酮含量分別為11.976mg·g－1（1.20%）與9.894mg·g－1（0.99%），盡管葉比莖的總黃酮含量高出約21%，但二者均可入藥。

3 討論

大量研究表明黃酮類化合物因具有擴張冠狀動脈、降血壓、降血脂、抑制血小板聚集、降低血管脆性、抗菌、抗癌等作用而引起人們的高度重視［2］。分析測定黃酮類化合物的方法有許多，而目前應用最廣的方法仍是HPLC法和分光光度法。HPLC法具有分離效率高、分析速度快、檢測靈敏度高等優點，但設備昂貴、操作要求高。采用反相HPLC法時由于黃酮類化合物未解離的羥基與固相作用較強而導致拖尾，加酸雖然可以克服拖尾現象，但是酸對儀器具有腐蝕性［3］。分光光度法根據黃酮類化合物與Al3＋絡合顯色的原理進行分析測定，所用設備簡單、操作容易，特別適合測定總黃酮的含量［4-5］。

用甘木通藥材生產制劑時是莖、葉混合提取，但甘木通確切的有效部位尚不明確，以甘木通中的有效成分黃酮類化合物為檢測指標，本實驗采用分光光度法測定甘木通葉與莖中總黃酮類化合物的含量分別為1.12%和0.99%，盡管葉中總黃酮含量比莖高出21%，但是比較接近，說明莖、葉均可入藥，并可以混合在一起提取。此外，本實驗的精密度試驗和回收率試驗均較好，在甘木通確切的有效成分尚不明確而缺乏質量控制標準的情況下，該方法暫可用于甘木通藥材及其制劑的質量控制。

［1］傅銳斌，邱建，馬俊，等.冠心康片治療冠心病心絞痛臨床療效研究［J］.中藥材，2005，28（11）：1045-1046.

［2］許實波，梅雪婷，許東暉，等.26種黃酮類天然活性成分的藥理研究進展［J］.中藥材，2003，26（1）：46-54.

［3］趙曉莉，岳紅.黃酮類化合物分析方法概述［J］.鹽湖研究，2005，13（2）：34-38.

［4］魏永生，王永寧，石玉平，等.分光光度法測定總黃酮含量的實驗條件研究［J］.青海大學學報（自然科學版），2003，21（3）：61-63.

［5］鄧桂春，王鑫，趙麗艷，等.分光光度法測定銀杏葉中黃酮的含量［J］.遼寧大學學報，2005，32（2）：101-104.

Determ ination of Total Flavonoids Contents from Leaves and Stem of Clematis Filamentosa Dunn

Hu Zongli，Huang Xiaoping，Chen Junxia
（Yingdong School of Bioengineering，Shaoguan University，Shaoguan Guangdong 512005，China）

Objective：To determinate the contents of total flavonoids from leaves or stem of Clematis filamentosa Dunn.M ethods：The total flavonoids from Clematis filamentosa Dunn were extracted with 75%alcohol at 90℃.Taking rutin as comparison product to make standard curve，the content of flavonoids was determinated by spectrophotomerty with the detection wavelength of 510nm.Results：Regression equation was C＝0.090 244A－0.000 193 6（r＝1.000 0）.The linear concentration was in the range of 0.007 5～0.060mg·mL－1for rutin.The average recovery was 101.18%，RSD was 2.36% （n＝5）.The average contents of total flavonoids from leaves or stem of Clematis filamentosa Dunn were 1.20%and 0.99%respectively.Conclusion：The total flavonoids content from leaves of Clematis filamentosa Dunn was higher over 21%than one from their stem

Clematis filamentosa Dunn；Total flavonoids；Spectrophotomerty

*胡宗禮，E-mail：sgu-hu-zl＠shou.com

2009-10-20）