腸膜狀明串珠菌葡聚糖亞種的分離鑒定及產乳酸研究

熊元林,陽 晗,劉雯雯,丁澤琴

（武漢生物工程學院生物工程系,湖北武漢 430415）

腸膜狀明串珠菌葡聚糖亞種的分離鑒定及產乳酸研究

熊元林,陽 晗,劉雯雯,丁澤琴

（武漢生物工程學院生物工程系,湖北武漢 430415）

從傳統泡菜中分離出27株乳酸菌,經過初篩和復篩得到產乳酸量較高的菌株PC09,經鑒定該菌屬腸膜狀明串珠菌葡聚糖亞種（Leuconostocmesenteroidessubsp.dex tranicum）;從番茄汁添加與否、發酵溫度、轉速、接種量等方面對 PC09產酸條件進行了研究。結果表明,在添加1%（體積分數）番茄汁、發酵溫度為33℃、轉速為100 r·min-1、接種量為2.0%的最佳產酸條件下,產酸量達到4.17%。

泡菜;乳酸菌;乳酸;發酵;正交實驗

乳酸菌是重要的益生菌種,其發酵產物乳酸是重要的生物化工產品,廣泛應用于食品釀造、生物制藥、卷煙、皮革、印染、化工、農業等領域[1,2]。由L2乳酸合成的聚乳酸是替代塑料的理想材料[3,4]。

目前,國內外乳酸的生產方法主要有化學合成法和微生物發酵法[5]。作者從泡菜中分離出27株乳酸菌,從中篩選出一株產乳酸較多的菌種,經鑒定為腸膜狀明串珠菌葡聚糖亞種（Leuconostoc mesenteroidessubsp.dex tranicum）,對其發酵產乳酸的條件進行了研究。為發酵法生產乳酸提供了理論依據,并且豐富了發酵法產乳酸的菌種。

1 實驗

1.1 材料與試劑

新鮮泡菜汁。

革蘭氏染色液,BTB2MR試劑等。

1.2 培養基

分離培養基[6]：M RS培養基、APT培養基、SL培養基、HP培養基、蔗糖硫胺培養基等。

鑒定培養基[6]：PY培養基。

發酵培養基[7]：葡萄糖 50 g,蛋白胨5 g,乙酸鈉5 g,M gSO4·7H2O 0.2 g,吐溫280 1 m L,M nSO4·H2O 0.0076 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,NaCl 0.01 g,ZnSO4·7H2O 0.2 g,蒸餾水 1 L,調 p H 值 5.9～6.7,115℃滅菌30 min。

1.3 菌種的分離純化

采用夾層平板法分離乳酸菌。樣品稀釋后涂于MRS2CaCO3培養基,迅速倒入5 m L冷卻至 45℃的半固體培養基,形成雙層平板,以隔絕空氣;培養后用接種針劃開表層瓊脂,將菌落在平板上劃線分離,同樣覆蓋一層半固體培養基。

1.4 菌種的鑒定

按文獻[6]方法進行乳酸菌鑒定。

1.5 乳酸含量的測定

采用EDTA定鈣法測定發酵液中乳酸的含量[8]。

1.6 發酵產酸條件的優化

從蕃茄汁添加與否、發酵溫度、轉速、接種量等方面進行單因素實驗,確定較適宜的發酵條件。根據單因素實驗結果,以發酵溫度、轉速、接種量為考察因素、以產酸量為考核指標,進行L9（34）正交實驗,以確定最佳發酵條件。

2 結果與討論

2.1 菌種分離鑒定

2.1.1 菌種分離結果

從泡菜汁中分離純化得到27株乳酸菌,分別編號為PC01～PC27。根據平板上CaCO3溶解圈的大小進行初篩,然后搖瓶復篩,得到產酸量較高的菌株PC09。

2.1.2 PC09菌株鑒定結果

生物學特性：細胞球形,呈鏈狀,革蘭氏陽性,不運動,無芽孢,兼性厭氧,接觸酶陰性,不產生吲哚,無還原硝酸鹽能力,不能在p H值4.8以下生長,能發酵蔗糖產葡聚糖,菌落光滑圓整,乳白色。PC09發酵碳水化合物產酸實驗結果見表1。

表1 PC09菌株發酵碳水化合物的結果Tab11 Fermentation results of carbohydrates by PC09

根據文獻[6],判定PC09菌株為腸膜狀明串珠菌葡聚糖亞種（Leuconostoc mesenteroidessubsp.dex t2ranicum）。

2.2 添加番茄汁對PC09發酵產酸的影響

在基礎發酵培養基中添加1%（體積分數,下同）番茄汁進行發酵,測定產酸量,并與不加番茄汁的發酵產酸量進行比較,結果見圖1。

圖1 番茄汁對PC09發酵產酸的影響Fig.1 Effect of tomato juice on fermentation of PC09

由圖1可以看出,發酵培養基中添加1%的番茄汁有利于PC09產生乳酸。主要是由于番茄汁中含有大量生長因子而有利于該菌的生長及產酸。

2.3 發酵溫度對PC09發酵產酸的影響

在添加1%番茄汁的基礎上,分別于27℃、29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃進行發酵 ,測定產酸量 ,結果見圖2。

由圖2可以看出,發酵溫度為35℃時,產酸量最大。

2.4 轉速對PC09發酵產酸的影響

在添加1%番茄汁、35℃條件下,分別采用60 r·m in-1、80 r·min-1、100 r·m in-1120 r·min-1、140 r·min-1、160 r·min-1、180 r·min-1轉速進行發酵 ,測定產酸量,結果見圖3。

圖2 發酵溫度對PC09發酵產酸的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on fermentation of PC09

圖3 轉速對PC09發酵產酸的影響Fig.3 Effect of rotating speed on fermentation of PC09

由圖3可以看出,轉速為100 r·m in-1時,產酸量最大。

2.5 接種量對PC09發酵產酸的影響

在添加1%番茄汁、35℃、100 r·min-1的條件下,分別采用 1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的接種量進行發酵,測定產酸量,結果見圖4。

圖4 接種量對PC09發酵產酸的影響Fig.4 Effect of inoculum amoun t on fermen tation of PC09

由圖4可以看出,接種量為2.0%時,產酸量達到最大。

2.6 正交實驗結果

根據單因素實驗結果,以發酵溫度、轉速、接種量為考察因素,每個因素選擇3個水平,以產酸量為考核指標進行正交實驗。因素與水平見表2,結果與分析見表3。

表2 正交實驗因素與水平Tab12 Factorsand levels of orthogonal experiment

表3 正交實驗結果與分析Tab13 Resultsand analysis of orthogonal experiment

由表3可以看出,各因素對產酸量影響大小依次為B>A>C,即轉速對 PC09產酸影響最大。這可能是因為腸膜狀明串珠菌葡聚糖亞種屬于兼性厭氧微生物,高濃度氧氣反而對其產酸不利。最優組合為A1B2C2,即發酵溫度33℃、轉速100 r·min-1、接種量2.0%,此時產酸量達到4.17%。

2.7 討論

（1）夾層平板法是分離純化乳酸菌的較好方法,主要是因為乳酸菌多數屬于厭氧或兼性厭氧;少數屬于微好氧,上層半固體瓊脂一方面能隔絕空氣,另一方面也不妨礙菌種挑取。

（2）由于乳酸菌多數為厭氧微生物,所以發酵過程中搖瓶轉速不宜過快。

3 結論

從傳統泡菜中分離出27株乳酸菌,經過初篩和復篩得到產乳酸量較高的菌株PC09,經鑒定該菌屬腸膜狀明串珠菌葡聚糖亞種,在添加1%番茄汁、發酵溫度為33℃、轉速為100 r·min-1、接種量為2.0%的最佳產酸條件下,產酸量達到4.17%。

[1] Litchfield J H.Microbiological production of lactic acid[J].Adv Appl Microbiol,1996,42：45295.

[2] 楊潔斌,郭興華,張篪.乳酸菌-生物學基礎及應用[M].北京：中國輕工業出版社,1996：2032206.

[3] 金其榮,張繼民,徐勤.有機酸發酵工藝學[M].北京：中國輕工業出版社,1997：3392340.

[4] H.G施萊杰（德國）,著.陸衛平,周德慶,郭杰炎,等譯.普通微生物學[M].上海：復旦大學出版社,1990：2672275.

[5] 陳俊亮,楊麗杰,霍貴成.產α2半乳糖苷酶乳酸菌的鑒定及其發酵性能研究[J].山東大學學報,2008,43（7）：28232.

[6] 凌代文,東秀珠.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M].北京：中國輕工業出版社,1999：54257,842108.

[7] 田豐偉,丁虎生,丁納,等.產胞外多糖的乳酸菌的簡便篩選與鑒定[J].食品與發酵工業,2008,34（3）：15219.

[8] 楊雪,陶興無,高冰,等.發酵大頭菜中乳酸菌的分離鑒定及生產初試[J].中國釀造,2008,（5）：31233.

Isolation,Iden tification of Leuconostoc M esenteroides Subsp.Dextranicum and Study on Acid2Production Conditions

XIONGYuan2lin,YAGN Han,L IUWen2wen,D ING Ze2qin
（Department of B ioengineering,W uhan B ioengineering Institute,W uhan430415,China）

Total 27 strains of lactic acid bacteria were isolated from home2made pickles.After screening and re2 screening,strain PC09 producing higher amountof lactic acid wasobtained and determined asLeuconostocmesenteroidessubsp.dextranicum.The acid2p roduction conditions for PC09 such as the tomato juice adding or not,fermentation tem2 perature,rotating speed,inoculum amount were studied.The results showed that the acid2p roduction reached 4.17%under the optimum conditions as follow s：adding 1%tomato juice,fermentation temperature 33℃,rotating speed 100 r·min-1and inoculum amount 2.0%.

pickles;lactic acid bacterium;lactic acid;fermentation;o rthogonal experiment

Q 93919 TS 201.3

A

1672-5425（2010）06-0059-03

武漢生物工程學院校基金資助項目（200704）

2010-03-16

熊元林（1978-）,男,湖北麻城人,碩士,講師,研究方向：應用微生物。E2mail：coolice2hust@sohu.com。