黑曲霉脂肪酶全基因合成及其在畢赤酵母中的表達

李 娜,袁利玲,張瑋瑩,李書祥,袁永澤,楊江科,閆云君,劉德立

（1.華中師范大學生命科學學院遺傳調控與整合生物學湖北省重點實驗室,湖北武漢430079;2.華中科技大學生命科學與技術學院,湖北武漢 430074）

黑曲霉脂肪酶全基因合成及其在畢赤酵母中的表達

李 娜1,袁利玲1,張瑋瑩1,李書祥1,袁永澤1,楊江科2,閆云君2,劉德立1

（1.華中師范大學生命科學學院遺傳調控與整合生物學湖北省重點實驗室,湖北武漢430079;2.華中科技大學生命科學與技術學院,湖北武漢 430074）

黑曲霉脂肪酶是重要的工業用酶,在食品、制藥、前體化合物的合成和手性化合物的拆分等方面有廣泛的用途。獲得高效表達黑曲霉脂肪酶的基因工程菌是該酶工業化生產的前提。根據黑曲霉脂肪酶L IP的氨基酸序列及畢赤酵母密碼子的偏愛性,設計合成26條相互重疊20 bp的引物,通過組裝PCR分別合成lip基因的4個片段lipA 1（300 bp）、lipA 2（237 bp）、lipA 3（234 bp）和 lipA 4（210 bp）。再以基因頭 lip1 和基因尾 lip26 為引物 ,以 lipA 1、lipA 2、lipA 3 和lipA 4混合物為模板進行第二輪PCR擴增,得到的產物經加A處理后,連接到載體pMD182T上,挑取重組子測序。通過PCR擴增對人工合成的基因進行校正,得到完全正確的lip基因。將優化后的基因克隆到表達載體p PIC9K上,獲得的重組質粒p PIC9K2lip經線性化后轉化畢赤酵母 GS115菌株,構建分泌型表達L IP的酵母工程菌,G418梯度篩選,得到高拷貝穩定整合菌株。為重組黑曲霉脂肪酶的規模化制備奠定了基礎。

黑曲霉;脂肪酶;全基因合成;畢赤酵母;表達

脂肪酶（EC3.1.1.3）是一類水解油脂的酶類,可催化油水界面的甘油三酯水解生成甘油及長鏈脂肪酸[1],是一種重要的工業用酶,廣泛應用于油脂化學、食品加工、精細化工、去污劑添加劑、手性化合物拆分、生物柴油合成等諸多工業領域[2]。黑曲霉脂肪酶因其良好的生物安全性,可作為傳統食品加工中重要的食品添加劑[3];同時,在前體物的合成和手性化合物的拆分等領域也有很好的應用前景。

巴斯德畢赤酵母表達系統能高效表達外源蛋白,具有外源蛋白表達量高且易于純化、營養要求低、生長快、適于高密度發酵等優點,因而廣泛用于工業化生產[4],但由于畢赤酵母和黑曲霉在密碼子使用頻率上的差異,使原有密碼子在畢赤酵母中整體表達頻率較低。

作者在此采用畢赤酵母表達系統,將黑曲霉脂肪酶基因lip按畢赤酵母密碼子的偏愛性進行改造,并人工合成后克隆至分泌型表達載體p PIC9K中,構建了畢赤酵母分泌型重組表達載體p PIC9K2lip,轉化GS115獲得高效表達L IP的酵母工程菌株,經 G418篩選獲得高拷貝穩定整合菌株,為大規模制備黑曲霉脂肪酶奠定了基礎。

1 實驗

1.1 材料

大腸桿菌DH5α、畢赤酵母 GS115、質粒p PIC9K,自行保存;PrimeSTARTMHS DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內切酶（EcoRI、N otI）,TaKaRa公司;SalI,寶生物工程（大連）有限公司;質粒提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒、膠回收試劑盒,A xygen公司;電泳儀、電轉儀,BioRad公司。

引物合成和測序委托上海捷瑞生物工程有限公司完成。

培養基 YPD、MD、MM、BM GY、BMM Y 按 In2 vitrogen公司操作手冊推薦方法配制。

1.2 方法

1.2.1lip基因遺傳密碼的優化、引物的設計與合成

根據黑曲霉脂肪酶lip基因的核苷酸序列（Gen2 Bank Accession No.DQ647700）,在Bioedit軟件的輔助下推導出該基因的核苷酸序列;將起始密碼子A TG和終止密碼子 TAA分別添加于lip序列的5′端和3′端;在DNAWorks[5]在線軟件的輔助下,以畢赤酵母密碼子使用頻率為基準,對該基因的密碼子進行優化,設計26條相互重疊20 bp的引物,分別記為lip1～lip26;引物lip1和lip26分別引入EcoRI和N otI酶切位點。引物合成片段經過脫鹽、PAGE純化后備用。

1.2.2 全基因序列的人工合成及校正[6]

將設計的相互重疊的引物分為4組,分別進行PCR反應,其 PCR產物分別命名為lipA 1、lipA 2、li2 p A 3和lipA 4。再以lip A 1、lip A 2、lipA 3和lipA 4為模板,以lip1和lip26為引物進行PCR擴增,合成黑曲霉脂肪酶lip′。合成后的全基因片段經測序分析,結果顯示合成的片段有堿基缺失、增加、突變的錯誤,再以合成的基因lip′為模板,通過PCR擴增對合成基因進行校正,校正后的黑曲霉脂肪酶全基因lip克隆至pMD182T載體,連接產物轉化后篩選獲得陽性克隆子,PCR檢測后,送上海捷瑞生物工程有限公司進行序列分析。

1.2.3 黑曲霉脂肪酶成熟肽基因的獲得

以合成的全基因序列為模板,以lip227（5′2GGTTC2 CGGAATTC TCTGTTTCTACTTCTACTTTGGATG 2 AATTG23′,下劃線處為EcoRI酶切位點）和 lip26（5′2 GGTTCCGCGGCCGCTTACAACAAACATTCAGAA 2 ATAGC 23′,下劃線處為NotI酶切位點）為引物擴增得到黑曲霉脂肪酶的成熟肽基因lip227。

1.2.4 重組酵母表達質粒p PIC9K2lip和p PIC9K2lip227的構建

以 lip1（5′2GGTTCCGAA TTCA TGTTTTCTG2 GTAGA TTTGGTGTTTTGTTGACTGC23′,下劃線處為EcoRI酶切位點）和lip26為引物擴增全長脂肪酶基因,以lip227和lip26為引物擴增成熟肽脂肪酶基因。PCR產物經EcoRI和N otI酶切后,插入經相同酶切的p PIC9K載體,構建重組質粒p PIC9K2lip和p PIC9K2lip227[7]。

1.2.5 重組畢赤酵母工程菌的構建及高拷貝轉化子的篩選

采用質粒制備試劑盒提取p PIC9K2lip和p PIC9K2lip227約5μg,并用SalI將其線性化。酶切產物經沉淀、洗滌、干燥后,用10μL水溶解備用。電擊轉化線性化的重組表達質粒p PIC9K2lip和p PIC9K2lip227,并整合到畢赤酵母 GS115細胞基因組中。轉化涂布MD平板,30℃培養2～4 d,觀察轉化子的生長。將陽性克隆子依次轉接至含 G418的MD平板,篩選高濃度 G418正常生長的菌落為高拷貝整合菌株[8]。

1.2.6 高拷貝整合菌株的篩選和PCR鑒定

利用煮 -凍 -煮方法[9]提取有 p PIC9K2lip、p PIC9K2lip227和p PIC9K的重組酵母基因組DNA,分別以lip1、lip227和lip26為引物,檢測外源基因的整合情況,PCR擴增條件：94℃5 min;94℃30 s,55℃30 s,72℃1 min,30個循環;72℃10 min[10]。瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產物。

1.2.7 重組轉化子搖瓶培養及誘導表達

將重組轉化子和對照菌株接種于50 mL BM GY培養液中,30℃、200 r·min-1振蕩培養16～20 h至OD600為2～6,離心收集菌體,加BMM Y培養基稀釋至OD600為1.0。每隔24 h補加甲醇,使其終濃度為0.5%進行誘導表達。取1 m L發酵液于4℃離心10 min,然后取上清液10μL上樣,進行12%SDS2PAGE電泳,考馬斯亮藍R250染色,分析檢測目的蛋白的表達水平和分子量[11]。

1.2.8 重組脂肪酶的酶活測定

采用以橄欖油為反應底物的NaOH滴定法[12]和p2NPP法[13]測定發酵上清液中脂肪酶的活力。

酶活單位（U）定義為：每分鐘水解底物生成1 μmol對硝基苯酚所需的酶量。

2 結果與討論

2.1 lip基因片段的獲得

黑曲霉脂肪酶全基因lip的人工合成過程如圖1所示。

第一步是小核苷酸片段的合成與組裝,PCR反應體系包括：lip1/（9）/（15）/（21）,1μL;lip8/（14）/（20）/（26）,1μL;模板 lip227/（10214）/（16219）/（212 25）,各 1μL;5×PrimeSTARTMbuffer,10μL;dN TP,4μL;PrimeSTARTMHSDNA聚合酶,0.5μL;H2O,21.5μL。PCR條件為：98℃變性10 s,53℃退火15 s,72℃延伸 45 s,共 25個循環,最后 72℃延伸 7 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測,得到4個大小分別為 300 bp、237 bp、234 bp 和 210 bp 的片段 lipA 1、li2 pA 2、lipA 3和lipA 4。

第二步是脂肪酶全基因的合成。PCR反應體系為：lip1,1μL;lip26,1μL;lipA 1、lipA 2、lipA 3、lipA 4,各1μL;5×PrimeSTARTMbuffer,10μL;dN TP,4 μL,PrimeSTARTMHS DNA聚合酶,0.5μL;H2O,29.5μL。PCR條件同第一步,PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測,得到大小925 bp左右的片段,和理論大小919 bp相符（圖2）。

圖1 黑曲霉脂肪酶全基因lip的人工合成示意圖Fig.1 The synthesis of Aspergillus niger lipase lip

圖2 人工合成黑曲霉脂肪酶全基因lip的PCR擴增Fig.2 The PCR of synthesized Aspergillus niger lipase lip

合成的全長基因在 Taq DNA聚合酶的作用下進行末端加A處理后,將其連接到載體pMD182T上,并對陽性克隆子的插入片段進行序列分析。結果表明,所獲得的插入片段序列與預期設計的相一致（合成基因的序列見圖3）。

2.2 重組酵母表達載體的構建及鑒定

擴增產物經EcoRI和N otI雙酶切,將得到的片段與同樣經過EcoRI和N otI雙酶切的p PIC9K質粒連接,構建重組酵母表達載體p PIC9K2lip（圖4）。

圖3 人工合成改造后的黑曲霉脂肪酶全基因lip序列Fig.3 lip Gene sequence of modif ied Aspergillus niger lipase

轉化宿主菌DH5α,提取質粒,多個克隆的DNA測序結果表明,通過人工全基因合成方法所獲得的黑曲霉脂肪酶基因與設計序列完全一致,序列正確的重組質粒經EcoRI和N otI雙酶切鑒定,分別得到919 bp的目的片段和約9.3 kb的載體片段。

2.3 GS115的轉化及高拷貝整合菌株的篩選

通過電激法將經SalI線性化的p PIC9K2lip質粒轉入畢赤酵母 GS115感受態細胞。在MD平板上培養4 d,共得到389個 His+轉化菌落。將重組質粒p PIC9K2lip轉化的 His+菌落、質粒p PIC9K轉化菌及宿主菌 GS115逐個點至MD平板（含 G418濃度分別為 1 mg·m L-1、2 mg·m L-1、3 mg·mL-1、4 mg·m L-1和5 mg·m L-1）。結果發現,在 G418濃度為1 mg·mL-1、2 mg·mL-1的平板上所有 His+菌生長無顯著差異;而當 G418濃度為3 mg·mL-1、4 mg·mL-1時,GS115生長緩慢;當 G418濃度為5 mg·m L-1時,只有極少數 GS115 His+菌生長,即得到高拷貝的整合菌株。挑選在5 mg·m L-1G418平板上生長良好的酵母轉化子進行 PCR鑒定,分析表明90%以上的轉化子染色體中整合了lip基因。

圖4 表達載體的構建示意圖Fig.4 Construction of the recombination plasm id

2.4 重組蛋白的表達（圖5）

M.Low molecular weight p rotein marker 1.GS115 Transformedw ith p PIC9K cultured 24 h 2～6.GS115 Transfo rmed w ithp PIC9K2lip cultured 24 h,48 h,72 h,96 h,128 h圖5 重組酵母上清的SDS2PAGEFig.5 The SDS2PAGEanalysis of fermentation

SDS2PAGE分析結果表明,重組酵母分泌了約39 kDa左右的重組蛋白質進入培養液。表明lip基因在畢赤酵母 GS115中實現了分泌性表達。

2.5 討論

在異源宿主中表達效率的主要影響因素是不同宿主間密碼子的使用頻率的差異,故通過對基因的重新設計和合成可以優化基因的表達,用宿主偏愛的密碼子來消除利用率低的或稀有的密碼子。實驗通過對黑曲霉脂肪酶基因進行重新設計和合成來優化其表達。在保證高正確率的前提下,為降低成本,將合成鏈長控制在60個核苷酸以下;為了使合成的基因在畢赤酵母中高效表達,選擇使用了畢赤酵母偏愛的密碼子;為了互補寡聚核苷酸退火后基因片段之間能很好連接,將相鄰核苷酸片段的連接粘端設計成互補堿基;為便于克隆表達,在基因兩端設計了必要的酶切位點EcoRI和N otI。在此基礎上合成了919 bp大小的黑曲霉脂肪酶全基因,測序結果表明人工合成的基因序列正確。這說明,通過PCR技術可以實現對優化基因的合成。運用此策略,可以設計合成優化的任何基因序列,為研究工作提供更多的材料。

巴斯德畢赤酵母是20世紀80～90年代發展起來的極具潛力的酵母表達系統,由于其在蛋白質表達方面具有其它系統所不可比擬的優點而得到越來越廣泛的應用[14]。重組畢赤酵母由于具有精確調控的乙醇氧化酶（AOX1）強啟動子并在合成培養基中易于高密度大規模培養等優點已成為近年來公認的最有效的外源表達系統之一[15]。畢赤酵母是甲醇營養性酵母,在缺乏抑制性碳源時,由于AOX1強啟動子受甲醇的嚴格誘導表達,使畢赤酵母能利用甲醇為唯一碳源。p PIC9K表達載體采用了AOX1高效表達啟動子[16],本研究將人工合成的具有酵母密碼子偏愛性的目的基因插入到p PIC9K表達載體,SalI線性化后通過同源重組的方式整合到酵母染色體中而實現分泌表達。

舒正玉等[17]實現了黑曲霉脂肪酶基因在畢赤酵母中的分泌性表達,但其重組脂肪酶水解橄欖油的比活力低于原始野生菌株脂肪酶的比活力。

3 結論

設計并人工合成了由畢赤酵母偏愛密碼子組成的lip基因序列,合成了優化的黑曲霉脂肪酶基因lip,成功構建了畢赤酵母表達載體p PIC9K2lip,經 G418抗性篩選獲得了高拷貝的菌株,搖瓶發酵液上清酶活提高了5倍。為脂肪酶的大規模表達純化奠定了基礎。

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The Total Gene Synthesis of Aspergillus N iger L ipase and the Construction Expression in Pcihia Pastoris

L INa1,YUAN L i2ling1,ZHANGWei2ying1,L IShu2xiang1,YUAN Yong2ze1,YANG Jiang2ke2,YAN Yun2jun2,L IUDe2li1
（1.L aboratory of Genetic Regulation and Integrative B iology,College of L ife Science,
Central China N orm al University,W uhan430079,China;2.College of L ife Science and Technology,H uazhong University of Science and Technology,W uhan430074,China）

Aspergillus nigerlipases are impo rtant biocatalysts w idely used in industries fo r food p rocessing and pharmaceutical p reparation.High2level exp ression recombinants can lead to cost effective lipase large scale p roduction.Total gene synthesis is an efficientmethod to enhance the exp ression level of the gene.According to themature pep tide sequence ofAspergillus nigerlipase and codonsof p reference inPichia pastoris,26 p rim2 ersw ith 20 bp overlaps at both 5′and 3′ends between adjacent oligonucleotideswere designed and synthesized.Fragments lipA 1（300 bp）,lipA 2（237 bp）,lipA 3（234 bp）and lipA 4（210 bp）were separately synthesized by as2 sembly PCR,and then they were used as the temp late to get the full length gene.The synthetic gene was se2 quenced and p roved to be the same as the designed.Thelipgene w as cloned into p PIC9K secreto ry exp ression vector.The construct was linearized w ithSalIand transfo rmed intoP.pastorisstrain GS115,and stablemul2 ticopy integrantswere screened in medium containing different concentrationsof G418.Thisoffers efficient re2 combinantP.pastorisstrains for mass p roduction of lipase.

Aspergillus niger;lipase;total gene synthesis;Pichia pastoris;exp ression

Q 786

A

1672-5425（2010）06-0045-05

國家自然科學基金資助項目（30771429）,科技部“863”資助項目（2007AA 05Z417）,教育部博士點基金資助項目（20060511002）,湖北省科技攻關項目（2007AA 201C50,2007AA 301C26）

2010-03-29

李娜（1981-）,女,湖北巴東人,碩士研究生,研究方向：生物化學與分子生物學;通訊作者：劉德立,教授。E2mail：deli2 liu2002@yahoo.com.cn。