谷物種子貯藏蛋白的結構、特性及其在谷物利用中的功能

李興軍

(國家糧食局科學研究院,北京 100037)

谷物種子貯藏蛋白的結構、特性及其在谷物利用中的功能

李興軍

(國家糧食局科學研究院,北京 100037)

在谷物成熟種子中,貯藏蛋白占總蛋白的 50%,對種子萌發(fā)與糧食儲藏、人和牲畜的營養(yǎng)供給、糧食加工的功能特性有重要影響。本文闡述了谷物醇蛋白和球蛋白的結構與特性、合成機制、運輸及其在發(fā)育種子內的沉積。面筋蛋白決定面包加工小麥品種的特性,介紹了如何調控它們的數(shù)量與組成,以改變面團混合特性。這些研究進展對我國谷物育種、儲藏及加工品質評價有指導和借鑒意義。

谷物 貯藏蛋白 醇蛋白 面筋蛋白 功能特性 蛋白體

谷物是世界上最重要的糧食作物,年產量超過210億 t,其中玉米、小麥及稻谷年產量占總產量的85%,大麥、高粱、黍、燕麥及黑麥等產量依次減少。我國大宗谷物年產量約 5億 t,其中稻谷、小麥、玉米占總產量的 86%。谷物蛋白含量相對豆類來說較低,占種子干重的 10%～15%,但卻為全球人和動物提供 20億 t蛋白,這個數(shù)量是高蛋白 (20%～40%)豆類種子的 3倍。除了營養(yǎng)功能外,谷物種子貯藏蛋白還影響其加工利用,尤其是對小麥加工品質。醇蛋白與面團的黏性和延展性有關,其多態(tài)性可以作為小麥的指紋,用于品種鑒定、純度分析及親緣關系研究[1]。高分子質量 (HMW)麥谷蛋白影響面團彈性,過去的研究集中在高分子質量谷蛋白亞基(HMW-GS),近年來重視研究低分子質量谷蛋白亞基(LMW-GS)的多態(tài)性及其與HMW-GS相互作用形成聚合物[2-4]。本文主要對谷物貯藏蛋白的結構、合成調控及在谷物利用中的功能作一概述,以期對我國大宗谷物儲藏、加工利用、品質改良及制定科學品質評價標準提供指導。

1 谷物種子貯藏蛋白種類

1745年Beccari首次分離了小麥面筋蛋白 (glu2 ten),之后 250多年人們對谷物種子蛋白進行了系統(tǒng)研究[5]。Osborne(1859～1929)被稱為植物蛋白化學之父。他根據(jù)植物蛋白的溶解性進行分類,如溶于水的清蛋白,溶于稀鹽的球蛋白,溶于醇溶液的醇蛋白,溶于稀酸或稀堿的谷蛋白[5]。他的分類法被廣泛地采用。目前普遍將種子蛋白分為貯藏蛋白、結構與代謝蛋白及保護蛋白 3類[5]。種子貯藏蛋白屬于Osborne劃分的三個不同成分,存在于種子的三種組織中。

1.1 貯藏球蛋白 (Storage proteins)

胚和糊粉層細胞含有貯藏球蛋白。根據(jù)沉降系數(shù)將球蛋白分為7S和11S兩種。一些玉米品種中種子胚細胞內球蛋白易溶于稀鹽溶液,沉降系數(shù)是 7。它們的氨基酸序列與豆類及其他雙子葉植物的 7S vicilins類似或同源,彼此之間有相似的結構和特性[6]。在小麥、大麥及燕麥的胚或糊粉層細胞中也鑒定了相關球蛋白。定性的水稻胚 7S球蛋白與其他植物 7S球蛋白的關系還沒有建立。7S球蛋白儲存在蛋白體內,功能是僅作為種子貯藏蛋白,它們對正常種子的功能不是必需的,如玉米 7S球蛋白缺乏突變株系能夠正常地發(fā)芽與生長。與胚乳組織比較,糊粉層和胚組織富有蛋白質,這些組織中的球蛋白對谷物加工特性影響不大。對于小籽粒谷物,糊粉層和胚組織占種子干重的 10%,通過小麥磨粉(milling)、稻谷礱谷 (polishing)、大麥去殼 (pear2 ling)、高粱剝殼 (decortication)等方法除去這些組織后,剩余的胚乳細胞成分供人們消費。玉米胚組織占種子質量的 10%～11%,高含量的蛋白和油是牲畜的營養(yǎng)來源。

一些谷物胚乳細胞中還存在 11S～12S貯藏球蛋白。這些蛋白在燕麥和稻谷中形成重要的胚乳貯藏蛋白,占總貯藏蛋白含量的 70%～80%。它們類似大多數(shù)雙子葉植物中廣泛分布的‘legumin’球蛋白。水稻胚乳貯藏蛋白不易溶于稀鹽溶液,被稱為‘glutelins’,屬于 11S～12S球蛋白家族。11S～12S貯藏球蛋白的組成亞基分子質量約 55 ku,翻譯后加工成的酸性肽 (燕麥的為 33 ku,稻谷的為 28～31 ku)和堿性肽(燕麥的為 23 ku,稻谷的為 20～22 ku)通過一個二硫鍵連接。燕麥球蛋白也類似 legumin,形成六聚體結構,沉降系數(shù)是 12。與 legumin相關的小麥貯藏球蛋白叫‘triticins’,存在胚乳中,占種子總蛋白質量的 5%。Triticins包括分子質量為 40 ku的大肽鏈和分子質量為 22～23 ku的小肽鏈,形成二聚體結構,不是典型的 legumin六聚體。與大麥和小麥比較,燕麥種子的貯藏球蛋白含量最高,而且必需氨基酸含量高,適合作為飼料。

1.2 貯藏醇蛋白 (Prolamins)

除了燕麥和稻谷外,所有谷物胚乳細胞的重要貯藏蛋白是醇蛋白。這個詞語 prolamin依據(jù)這些蛋白富含脯氨酸 (proline)和谷酰胺 (glutamine)的氨基氮,不同谷物類型中這兩種氨基酸含量之和占醇蛋白的 30%～70%。根據(jù)最初定義,醇蛋白溶解于醇的水溶液,如 60%～70%乙醇、50%～55%丙醇或異丙醇。還有一些醇不溶聚合蛋白,但是所有醇蛋白聚合物在還原態(tài)時都是醇溶的。醇蛋白分子質量變化范圍大,從 10～100 ku。

作為貯藏蛋白,醇蛋白與 7S和 11/12S球蛋白比較,在蛋白質結構上變異較大。麥亞科 (Triticeae,如小麥、大麥及黑麥)和黍亞科 (Panicoideae,如玉米、高粱及黍)的重要醇蛋白類型在系統(tǒng)進化上是獨立的。大多數(shù)醇蛋白有兩個共同的結構特征,一是存在特征區(qū)域或結構域,這些結構域彼此之間結構不同,起源可能不同;二是在氨基酸序列中存在一個或多個短肽基序,或存在特定氨基酸殘基如甲硫氨酸的重復區(qū)塊。這些特征解釋了一些醇蛋白類型中存在的高比例谷氨酰胺、脯氨酸及其他特異氨基酸(如組氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸)。

1.2.1 小麥醇蛋白及醇蛋白家族 (Cereal Prolamin Family)

由于分離的醇蛋白成分復雜和術語專業(yè)化,該蛋白的結構和特性較難理解。目前依據(jù)代表材料的已知醇蛋白類型氨基酸序列,按照結構與進化關系將麥類(小麥、大麥及黑麥)所有醇蛋白分為富硫 (S -rich)、貧硫 (S-poor)及高分子質量 (HMW)醇蛋白 3大類型 (表 1),富硫類型還有幾個亞類型[5]。這種劃分方法與谷物化學家劃分的小麥多聚物蛋白(谷蛋白)和單聚物蛋白 (醇蛋白)不是一一對應的,因為富硫、貧硫醇蛋白都有單聚物或多聚物態(tài)。

表1 小麥種子醇蛋白類型和特征

圖 1是小麥富硫、貧硫及高分子質量醇蛋白的結構。它們全都富含脯氨酸、谷氨酰胺基序的重復序列。富硫與貧硫醇蛋白的重復基序是相關的。富硫醇蛋白與HMW醇蛋白之間的非重復結構域也存在序列相似性,尤其是在保守的半胱氨酸位置及靠近這些半胱氨酸的氨基酸殘基。這些對比分析表明,富硫、貧硫及 HMW醇蛋白之間有共同的起源進化關系。廣泛地比較玉米醇蛋白(zein)、燕麥和稻谷醇蛋白 (prolamins)、雙子葉植物種子2S貯藏清蛋白、谷物種子α-淀粉酶和胰島素抑制劑、包括脂肪轉移蛋白和谷物種子puroindolines在內的LMW富半胱氨酸植物蛋白,發(fā)現(xiàn)也存在進化和結構類似關系。于是將這些醇蛋白統(tǒng)稱為谷物醇蛋白超級家族 (ce2 real prolamin superfamily)。谷物醇蛋白普遍具有營養(yǎng)功能,但是只有小麥的醇蛋白與加工品質相關。小麥醇蛋白是面筋蛋白(gluten)重要構成成分,面筋蛋白形成面團的黏彈性網絡,在小麥加工成面食、面包及其他產品中起重要作用。

圖 1 小麥三種醇蛋白類型

1.2.2 玉米醇蛋白 (prolamins ofmaize)

玉米醇溶蛋白 (zeins)于 1821年從玉米中分離出來,缺乏賴氨酸、色氨酸,但富有谷酰胺、脯氨酸、丙氨酸及亮氨酸。它有凝膠化、黏結及形成膜等特征。玉米醇蛋白與其他黍亞科谷物如高粱、黍的醇蛋白構成一個大類(α-zeins)與幾個小類(β-、γ-、σ-zeins)(圖 2a)。氨基酸序列對比分析表明,β-、γ-、σ-zeins都是醇蛋白超級家族的成員。γ-zeins含有 2個或 8個 Pro-Pro-Pro-Val-His-Leu的串聯(lián)重復氨基酸基序,β-和σ-zeins都富有甲硫氨酸,這些甲硫氨酸成簇區(qū)域靠近γ-zeins的 C-末端。玉米α-zeins僅僅與黍亞科其他谷物的α-型醇蛋白相似,與其他醇蛋白類型無明顯類似關系。SDS-PAGE分子質量分析表明,玉米α-zeins分為19 ku(Z19)和 22 ku(Z22)的兩大亞組,它們各自的實際分子質量是 23～24 ku和 26.5～27 ku[7]。這兩個亞組包括 20個氨基酸殘基的退化重復區(qū),Z19有9個重復區(qū),Z22有 10個重復區(qū) (圖 2b)。玉米αzeins每分子僅含有 1～2個半胱氨酸殘基,在種子中以單聚物或寡聚物存在,但是β-γ-、σ-zeins都富有半胱氨酸,形成了多聚物。

圖2 玉米醇蛋白

2 谷物種子貯藏蛋白的合成與沉積

2.1 貯藏蛋白的合成與沉積

谷物種子貯藏蛋白以分泌方式產生,沉積在單個的蛋白體內。蛋白體的起源、種子貯藏蛋白運輸與沉積的機理還不完全清楚。分別位于谷物胚與糊粉層細胞、胚乳細胞的7S和11S貯藏球蛋白,可能按照雙子葉植物種子的同源蛋白方式分泌、運輸及沉積。它們一般在粗面型內質網 (ER)膜上合成,邊翻譯邊被運輸?shù)絻荣|網腔內 (lumen),接著通過高爾基體運輸?shù)劫A藏球蛋白的液胞中,這些大量存在的球蛋白貯藏液胞不同于發(fā)育種子內同時存在的裂解型液胞[8]。貯藏球蛋白這種分類儲存的確切機制還沒有完全了解,但高爾基體內的物理聚集作用很重要,在電鏡下顯示電子密集型聚合物,這些聚合物形成濃密小泡的內含物。貯藏球蛋白沒有向液胞定向運輸?shù)目汕谐半?這種成熟蛋白不含前肽可能有重要意義。

與球蛋白比較,醇蛋白運輸與沉積機制了解更少,可能有 2種方式。在玉米、稻谷及其他黍型谷物(如高粱、黍)中,醇蛋白直接在 ER腔內積累,形成ER單層膜包裹的離散蛋白體[9]。在稻谷內存在 2個蛋白體群體,PB-I來自 ER,含有醇蛋白;PB-II來自液胞,含有球蛋白/谷蛋白[10],如圖 3a。Okita研究組提出證據(jù),醇蛋白和球蛋白/谷蛋白在各自的ER亞區(qū)域合成,醇蛋白的 mRNA被定位到粗面型ER,粗面型 ER與發(fā)育著的含醇蛋白的蛋白小體相關。球蛋白/谷蛋白的 mRNA被定位到更特定的潴泡 (cysternal)ER膜[11]。其他證據(jù)表明,醇蛋白 mR2 NA能夠結合到微管蛋白 (tubulin)和肌動蛋白細胞骨架 (actin cytoskeleton)的特定位點[12]。

圖 3 正在發(fā)育的谷物籽粒淀粉型胚乳細胞中的蛋白體

與稻谷類似,燕麥胚乳細胞內含有高比例的球蛋白類型貯藏蛋白。在這種情況下,球蛋白與醇蛋白位于同一蛋白體,醇蛋白是染色較輕的內含物(圖 3b)。這可能是 ER內的蛋白體 (含有醇蛋白)與液胞內的蛋白體 (含有球蛋白)發(fā)生了融合[13]。

玉米、稻谷及 (可能)燕麥醇蛋白在 ER內直接積累,還沒有證據(jù)表明被運輸?shù)揭喊?。已經證明在小麥、大麥及(可能)黑麥種子內,存在醇蛋白向液胞運輸與蛋白體形成兩個過程。其證據(jù)包括高爾基復合物內醇蛋白的免疫金標記,在 ER內觀察到小蛋白體或者與 ER相關的小蛋白體,通過亞細胞分離技術制備了 ER標記酶與蛋白體的結合物,在異源系統(tǒng)中表達野生型和突變體的醇蛋白[14]。結論是,一些醇蛋白(主要是小麥醇蛋白),通過高爾基體運輸?shù)劫A藏蛋白體的液胞,而其他醇蛋白 (主要是谷蛋白),保留在 ER內。ER內的蛋白體隨后以類似自我吞噬(autophagy)的方式被貯藏蛋白的液胞所吸收。在發(fā)育小麥種子內蛋白體也包含深染色的內含物即貯藏球蛋白 (triticin,圖 3c中 I),它可能通過高爾基體運輸?shù)揭喊麅鹊牡鞍左w中[15]。小麥兩類蛋白體融合的確切機制還不清楚。事實上,在小麥成熟干種子胚乳細胞內,存在圍繞淀粉粒并吞沒其他細胞結構殘渣的連續(xù)蛋白質基質。當小麥粉與水混合形成面團時,這個基質是形成面筋網絡的基礎。

醇蛋白是保留在 ER內,還是通過高爾基體運輸?shù)揭喊臋C制還不清楚。在這些醇蛋白中均沒有找見典型的 ER保持信號肽,即 C-端的四肽 KDEL或HDEL,或者液胞定位序列。在異源系統(tǒng)中分別表達玉米γ-zeins和小麥γ-gliadin,對野生型和突變型分析均表明,富脯氨酸重復序列對醇蛋白保留在 ER內是必需的[16]?？赡艿氖?這些富脯氨酸重復區(qū)域形成蛋白質 -蛋白質互作,導致不溶性聚合物的增大,在 ER內直接積累,而不是被運輸?shù)礁郀柣w和液胞[17]。Okita研究組提出不同的機理解釋醇蛋白保持在稻谷胚乳細胞的 ER內。這包括與分子伴侶Bip(binding protein,結合蛋白)的互作,Bip結合到初生的醇蛋白多肽,并將該多肽保留在 ER內,直到組裝成一個蛋白體[9]。但這個機制對其他谷物還沒有提出。

2.2 蛋白體內貯藏蛋白的構建

在發(fā)育著的淀粉型胚乳細胞中,燕麥 (圖 3b)和小麥(圖 3c)的蛋白體呈現(xiàn)球形小泡或不規(guī)則小泡兩種狀態(tài)。球形小泡以單層 ER膜包裹,含有醇蛋白;不規(guī)則小泡由液泡沉積物形成,含有球蛋白/谷蛋白。這樣,分別含有醇蛋白和球蛋白沉積物的兩類蛋白體群落最初是易區(qū)分的,隨后這兩類蛋白體就發(fā)生了融合,如水稻 (圖 3a)。鑒于醇蛋白與球蛋白的結構和特性不同,在胚乳細胞發(fā)育初期階段依據(jù)形態(tài),就可以區(qū)分含有醇蛋白或球蛋白的蛋白體群落。

由于不同的醇蛋白類型在電鏡下顯示相似的染色特性,所以蛋白體內不同類型醇蛋白的空間分布還沒有闡明。但 Lending等[18]研究顯示,蛋白體內玉米醇蛋白 (zeins)類型分布的差異性,與它們在發(fā)育胚乳組織中的位置相關。如圖 4,亞糊粉層區(qū)域幼齡細胞內的蛋白體,主要含有β-和γ-zeins,它們遍及整個蛋白體內。一旦轉遞到胚乳組織細胞內,這些蛋白體體積增大,中心位置出現(xiàn)含有α-zeins的小腔。這些小腔最終融合成一個連續(xù)的α-zeins中心區(qū)域,結果是成熟蛋白體中,β-和γ-zeins分布在α-zeins中心區(qū)域的周邊[19]。

圖4 玉米胚乳蛋白體發(fā)育的模式。

利用高度特異性α-、β-、γ-zeins抗體,很容易進行玉米胚乳細胞蛋白體發(fā)育研究。類似的研究對其他谷物還沒有報道。但是用不同小麥醇蛋白(gliadin)組分的研究表明,醇蛋白組分呈空間微相態(tài)(microphases)分布,所以能夠區(qū)分。將純化的αgliadin與ω-gliadin組分溶解在 70%的乙醇中,分別以 1∶3、1∶1及 3∶1混勻,涂抹到云母 (mica)表面,讓溶劑蒸發(fā)。在原子力顯微鏡下分析干膜的表面特性,兩個相態(tài)的比例約相關于混合組分的比率[20],這說明在小麥胚乳細胞蛋白體中,醇蛋白(gliadin)和谷蛋白(glutenins)可以依據(jù)各自的微相態(tài)區(qū)分,不過在常規(guī)電鏡下觀察不到。

采用異源系統(tǒng)表達試驗也表明,各種玉米醇蛋白(zeins)類型的混合物,對正常蛋白體的形成是必要的。轉基因煙草中γ-zein表達時,檢測到α-zein積累。在煙草中單獨表達β-zeins或σ-zeins時,形成了不正常的蛋白體,將兩者一起表達時則顯示正常的蛋白體[21]。從這些研究中看到,谷物蛋白體形成的機制,不同儲藏蛋白類型的作用與構建還需要研究。

2.3 淀粉型胚乳組織內醇蛋白的空間分布

在發(fā)育著的谷物胚乳組織內,糊粉細胞連續(xù)平周分裂,幼齡細胞就出現(xiàn)在亞糊粉層,老齡細胞存在胚乳組織的中心部位。在小種子谷物和黍亞科中,亞糊粉層細胞幾乎不含有淀粉粒,而且淀粉粒比胚乳組織中心部位細胞中的小,但是這些亞糊粉層細胞含有高比例的蛋白。就整個小麥胚乳組織,每個細胞內總蛋白含量變化不大。對玉米,在亞糊粉層和胚乳組織外層細胞,蛋白體中富有β-zeins、γzeins,但α-zeins含量較低,α-zeins均一地分布在整個胚乳組織。這種分布有助于玉米胚乳細胞中蛋白體的發(fā)育形成。盡管大麥及(可能)小麥胚乳組織內醇蛋白分布存在差異,但是這個現(xiàn)象的產生機制還不清楚。這兩個物種的亞糊粉層細胞富有蛋白質,對大麥進行免疫標記和去殼分析表明,這些蛋白質主要是富硫和貧硫醇蛋白(主要是B-和 C-hor2 deins),HMW醇蛋白 (D-hordeins)大量存在在亞糊粉層下胚乳細胞[22]。大麥和小麥胚乳組織中醇蛋白這種分布對籽粒加工利用很重要,由于D-hordeins是凝膠蛋白的主要成分,它限制了大麥發(fā)芽期間胚乳變化,而小麥谷蛋白的同源 HMW亞基是彈性 (elasto2 meric)聚合物的重要成分,在面包及其他食品加工利用中起支撐作用。

3 醇蛋白基因表達的調控

醇蛋白基因表達主要在轉錄水平進行調控,既是組織特異性發(fā)育調控,在種子發(fā)育中后期的胚乳組織中專一表達;也是營養(yǎng)調控的,對種子中硫和氮的可利用性反應敏感。對硫的反應,醇蛋白基因表達機制還不清楚。在小麥、大麥及黑麥中已經鑒定了一個基序,它參與富硫、貧硫醇蛋白基因表達對氮的反應。這個基序(N-基序或氮元件)位于高度保守的醇蛋白盒基因 (prolamin box)中[23]。醇蛋白盒基因,有時也叫胚乳元件,是第一個醇蛋白基因調節(jié)序列。通過比較分析幾個小麥醇蛋白 (gliadins)和大麥醇蛋白(hordeins)基因的起動子,鑒定了這個醇蛋白盒基因。這個醇蛋白盒基因序列 (長 30 bp)是5’-TGACATGTAA AGTGAATAAG ATGAGTCATG,在轉錄起始位點上游 300 bp處 (剛開始稱為 -300元件)。它 3′端保守的N-基序序列,在富硫醇蛋白基因中是G(A/G)TGAGTCAT,在貧硫醇蛋白盒基因中以反義互補形式存在。該 N-基序與酵母氮信號途經元件 (有時稱為 GCN4-like基序,GLM)GCN4的轉錄因子結合位點有相似性。醇蛋白盒基因中第2個高度保守的基序序列是TGTAAAGT,被稱為胚乳基序或者 E基序[24]。

將構建的大麥富硫醇蛋白(B-hordein)啟動子/氯霉素乙酰轉移酶 (chloramphenicol acetyl transfer2 ase,CAT)報告基因轉化煙草,結果顯示醇蛋白盒基因中含有功能性啟動子區(qū)域[25]。Hammond-Kosack等[24]表明醇蛋白盒基因具有自身的調節(jié)作用。Müller等[23]采用同源基因瞬時表達系統(tǒng),用基因槍法將大麥貧硫醇蛋白 (C-hordein)啟動子/β-葡萄糖醛酸酶 (β-glucuronidase,GUS)構建導入培養(yǎng)的大麥胚乳細胞。這個試驗證明了 E基序和N基序是獨立的元件,在低氮水平時N基序抑制基因表達;當?shù)匠渥銜rN基序與 E基序、其他上游元件相互作用產生高水平基因表達。

Hammond-Kosack等[24]利用體內足跡法和凝膠滯緩試驗分析表明,醇蛋白盒基因內 E基序、小麥低分子質量谷蛋白亞基基因啟動子上游的較遠序列,結合一個公認的轉錄因子 ESBF-Ⅰ。第二個公認的轉錄因子 ESBF-II在基因表達量最大之前結合N-基序。第三個公認的轉錄因子 SPA識別N基序。綜合這些結果,N-基序是富硫和貧硫醇蛋白基因氮調節(jié)機制的一個重要元件。它需要與 E基序相互作用,這兩個基序一起構成了醇蛋白盒基因。但是,不是所有醇蛋白基因都含有醇蛋白盒基因,例如玉米醇蛋白 (zein)基因啟動子含有一個高度保守的 15 bp元件,充當組織特異性表達的增強子。這個 15 bp的元件含有序列TGTAAAG,類似 E基序,但缺乏 N基序。γ-zein醇蛋白啟動子中存在N-基序,與 E-基序是分開的,它的功能還不清楚[26]。

完整的醇蛋白盒基因也不會出現(xiàn)在小麥 HMW醇蛋白基因啟動子中。HMW醇蛋白基因啟動子含有一個重要調節(jié)元件,序列是 5’-GTTTTGCAAA GCTCCAATTG CTCCTTGCTT ATCCAGCT。這個 38 bp的序列在所有 HMW醇蛋白啟動子中是高度保守的,起始位置在 -185到 -189[27]。這個元件包含TGCAAAG序列,類似玉米 zein基因中存在的 E基序TGTAAAG序列,但它不含有類似 N基序的序列。HMW醇蛋白基因啟動子上游到增強子之間的序列對應部分N和 E基序序列,這些序列的缺失不會明顯影響啟動子活性,至少在轉基因煙草中驅動報告基因表達。

4 種子貯藏蛋白與谷物加工利用

4.1 作為混合飼料成分

谷物種子貯藏蛋白是人和動物食用植物蛋白的主要來源。谷物種子的總蛋白含量是種子干重的10%～15%,其中貯藏蛋白占總蛋白含量的一半,對種子利用特性有重要影響。除過燕麥和稻谷外,醇蛋白是大多數(shù)谷物的重要貯藏蛋白成分,但是它缺乏必需氨基酸賴氨酸、亮氨酸、色氨酸 (尤其對玉米)。對豬、禽等動物長期喂養(yǎng)這些谷物,就導致這些必需氨基酸缺乏。因此將谷物與含有這些氨基酸的大豆、油料種子、魚粉等相結合,作為混合飼料。谷物富有含硫氨基酸,賴氨酸含量低,苜蓿種子則相反,將兩者混合就可以達到必需氨基酸互補。

4.2 種子萌發(fā)與糧食儲藏

如何避免種子衰老和陳化問題是種子生理學和糧食儲藏學研究的重要課題。種子活力與種子萌發(fā)時胚貯藏蛋白降解速率、新蛋白合成是一致的,不同活力的玉米胚吸脹 24 h的蛋白質合成能力及貯藏蛋白降解程度,可作為衡量玉米種子活力的生化指標[28-29]。我國遼寧省出土的、在地層中保存約 1450年的古蓮子,在人工處理下能夠發(fā)芽與開花。除了它堅硬的種子外殼阻止水、空氣進入外,貯藏蛋白及其他蛋白受到最小的損傷而使種子保持活力[30]。

4.3 面筋蛋白與小麥加工品質

谷物蛋白對其加工食品的功能特性有重要影響。除過稻谷外,大宗谷物都以加工品被消費,多數(shù)小麥通過磨粉除去胚芽 (胚)和麩皮 (包括果皮、種皮、珠心層及糊粉層),成為小麥粉。小麥粉來源淀粉型胚乳細胞,含有大量的淀粉和面筋蛋白。小麥粉之所以能夠加工成面包、面條、蛋糕、餅干及面食等,在于其種子貯藏蛋白的特性與其他谷物不同。這些蛋白質沉積在胚乳細胞內散布的蛋白體,在種子成熟后期蛋白體在細胞內結合形成一個連續(xù)的基質網絡。當小麥粉與水混合形成面團時,小麥粉粒子中的面筋蛋白集合在一起在面團中形成連續(xù)的網絡。這個網絡賦予面團黏結性、彈性及延展性。這些特性使得面筋蛋白網絡被酵母發(fā)酵釋放的 CO2所膨大,產生色亮、多孔瓤面包結構。所有小麥類型都能夠加工成面包,但是面包品質差異甚大,這種差異與小麥品種、生長環(huán)境及二者互作的遺傳差異有關。與北美、南/中歐干熱地區(qū)比較,英國、北歐生產的小麥面筋較弱,加工面包時需要與強筋小麥混合。

250多年來,小麥面筋蛋白黏彈特性形成的機制一直是研究的熱點,由于它與改良小麥加工利用特性有關。決定面團強度的最重要因子是一些谷蛋白形成聚合物的能力,谷蛋白聚合物由鏈間二硫鍵所穩(wěn)定,分子質量可以達到 1×104ku。已經明確了高分子質量谷蛋白亞基(HMW-GS),對大分子聚合物的形成重要作用。強筋面團(高度黏彈性)就含有高比例的 HMW-GS聚合物。對這個原理的認識是Payne[31]發(fā)現(xiàn)的,HMW醇蛋白 (即 HMW-GS)成分的等位變異,與歐洲面包小麥加工品質的差異呈相關性。HMW-GS占總面筋蛋白的8%～12%,它們詮釋了歐洲小麥面包加工品質變異的 45%～70%。之后其他學者都證實了這個相關性,于是HMW-GS的結構與特性被詳細地研究。由于谷蛋白聚合物較低的溶解性,缺乏結晶結構,所以對其結構分析較困難。HMW-GS能夠形成具有彈性的聚合物網絡,在與其他谷蛋白亞基、醇蛋白相互作用中,它提供支撐作用。鏈間二硫鍵對這個網絡起穩(wěn)定作用,特別是在重復結構域的谷氨酰胺殘基之間形成的鏈間氫鍵(圖 1),對彈性材料形成很重要[32]。谷蛋白超過一定的分子質量分布,其肽鏈才能形成彈性[33],較大的谷蛋白聚合物的分子質量分布造成富有彈性的面團,改善了面包的加工特性。面筋蛋白生物物理學特性形成的意義還不清楚,作為種子貯藏蛋白,不知道它們呈現(xiàn)黏彈性的目的是什么。可能的是,決定這些特性的分子間相互作用在發(fā)育著的種子中開始建立,從種子發(fā)育中期胚乳細胞分離的蛋白體,含有二硫鍵連接的谷蛋白聚合物,這些聚合物被證明具有黏彈性。蛋白二硫異構酶催化 ER內面筋蛋白之間二硫鍵形成,分子伴侶(Bip)在建立其他蛋白與面筋蛋白相互的確切作用,還不肯定。

4.4 調控 HMW麥谷蛋白亞基表達與改良小麥加工品質

六倍體面包小麥 (Triticum aestivumL.,2n=6x =42,AABBDD)是麥類中唯一適合加工發(fā)酵烘焙產品。編碼 HMW-GS基因位點Glu-1位于第 1部分同源染色體長臂上,而ω-醇蛋白基因位點 Glu-1和LMW-GS基因位點Glu-1連鎖位于短臂上。在第 6部分同源染色體的短臂上還有醇蛋 Glu-1基因位點[34-35]。面包小麥加工品質主要由 HMW-GS決定,有6個基因編碼 HMW-GS,兩個基因為一組連鎖位于基因組 A、B及D的 Glu-1位點。這些位點中每組連鎖基因分別編碼高、低分子質量的X-型和 Y-型亞基。由于基因沉默,Glu-A1編碼 0～1個亞基,Glu-B1編碼 1～2個亞基,Glu～D1編碼 2個亞基,所以面包小麥品種僅存在 3～5個 HMWGS。1Bx、1Dx及 1Dy亞基存在所有面包小麥品種, 1Ax或 1By亞基僅存在一些品種中。所有表達亞基在 SDS-PAGE電泳中根據(jù)相對遷移率編號為 2個或 2個以上等位基因編碼產物,如 1Dx2與 1Dx5亞基是等位基因編碼產物,1Dx5亞基在 SDS-PAGE中遷移率大。而且,編碼的 X-型和 Y-型亞基以“等位基因對”產物形式遺傳,如亞基 1Dx2+1Dy12與 1Dx5+1Dy10是等位基因產物。于是,基因表達及編碼蛋白的這種等位變異對面團強度產生數(shù)量和質量影響。數(shù)量效應與基因表達相關,尤其在 Glu-A1位點,1Ax亞基 (1A1或 1A23)的基因表達量增加,HMW-GS蛋白總量可以增加 2%[36]。質量效應的差異還不清楚,但認為與等位表達蛋白的不同結構與特性有關,如在 Glu-D1基因位點,與廣泛存在的等位基因產物 1Dx2+1Dy12、1Dx3+1Dy12及1Dx4+1Dy12比較,1Ax1+1Ay23、1Bx17+1By18、1Dx5+1Dy10亞基相關于優(yōu)質的面包加工品質。許多HMW-GS編碼基因已經從面包小麥分離,它們編碼 1Ax(1,23)、1Bx(7,17)、1By(9)、1Dx(2,5)及 1Dy(10,12)亞基[34],這使得通過遺傳工程改良小麥加工特性變得容易。

過去十多年里報道了在面包小麥品種表達HMW-GS基因,采用其自身的啟動子,或者另一HMW亞基基因的啟動子,被轉 HMW-GS基因的表達量接近或超過了內在基因的表達量。利用亞基1Dx5基因啟動子驅動編碼β-葡萄糖醛酸酶的UidA報告子基因在小麥表達,證明了被轉基因的表達僅限于胚乳組織。同時在溫室和田間對轉基因小麥試驗中,分析了 HMW-GS基因對面團強度的影響[37-38]。在 Glu-A1位點基因發(fā)生沉默的株系表達 1Ax1亞基,增加了面團強度,改善面包品質能夠達到內源 1Ax1亞基表達的水平。將 1Ax1亞基基因轉入不含有該基因的BobWhite小麥,轉基因小麥中HMW-GS 1Ax1亞基含量,是種子總蛋白的 0.6%～2.3%,以總 HMW-GS量計最高達到 71%[39]。1Dx5和 1Dy10共同表達的株系小麥粉混合時間 (即面團強度)顯著地增加。如果缺乏 1Dy10亞基表達,僅表達 1Dx5的株系 (歐洲小麥品種存在)產生不可預測的結果:小麥粉不能吸水,在揉混儀 (Mixgraph)中不能形成正常的面團,揉混儀曲線是扁平的,烘烤的面包體積小、質地色深。進一步分析表明,面筋蛋白顯示高比例的不溶性谷蛋白聚合物,流變學特性類似加入轉谷氨酰胺酶后面筋蛋白的交聯(lián)增加。亞基 1Dx5不同于所有其他 X-型亞基,在于氨基酸序列中多了一個半胱氨酸殘基,這導致在谷蛋白聚合物內或者之間,尤其在缺乏亞基 1Dy10時,發(fā)生不尋常的高水平交聯(lián)。這就解釋了谷蛋白聚合物的不溶性,不能發(fā)生正常的水合作用。1Ax1亞基的表達分析也表明遺傳改良能夠產生面團強度增加的小麥品種。對目前歐洲優(yōu)良面包小麥品種,采用直接轉化,或者雜交滲入模式小麥株系的基因,都能夠改良面團強度[40]。一些HMW-GS基因和LMW-GS基因已經轉化到面包 (Triticum aestivum)和面食 (Triticum turgidum)小麥品種。

HMW-GS與面包小麥加工品質明顯有關,可以選擇它們作為小麥品質遺傳改良的早期篩選標記。此外,由于LMW-GS與醇蛋白編碼基因是連鎖的,一些醇蛋白可以作為小麥品質改良的遺傳標記。我國學者對 113個小麥品系 (冬小麥品種國產 81個、澳大利亞 4個,春小麥品種國產 9個、國外 23個)鑒定面團強度和面包加工品質相關的醇蛋白亞基,發(fā)現(xiàn) Gli-D1位點連鎖基因編碼的ω-醇蛋白亞基 15 +16可以作為小麥加工品質改良的篩選標記[41]。

5 結語

谷物貯藏蛋白對種子品質形成及利用特性有重要作用。了解這些蛋白質的結構、生物物理學特性及其在種子內合成、運輸和沉積的生物學機制,對通過遺傳工程改良谷物加工利用品質有指導意義。由于小麥 HMW-GS等位基因是緊密連鎖的,利用常規(guī)育種方法操作它們就很困難。鑒定和克隆這些HMW-GS基因,通過遺傳轉化的方法將與面包加工品質相關的基因導入優(yōu)良栽培品種。早期的工作是研究增加小麥醇蛋白和谷蛋白亞基表達的轉基因技術,主要是探索異源系統(tǒng)表達技術,對表達蛋白的結構與功能涉及較少[42],而且轉基因操作主要針對易于轉化的模式材料(如BobWhite小麥),不是針對高產的小麥栽培品種。近來已經開始將轉入模式材料的基因通過常規(guī)育種技術滲入優(yōu)良栽培品種[40]。在逐步認識我國小麥資源醇蛋白和麥谷蛋白等位基因構成特性的基礎上,分析它們與小麥加工利用品質的關系,在育種中充分利用這些優(yōu)質基因,是一個重要的研究內容。

盡管大量研究證實通過遺傳工程調控小麥面筋蛋白的結構與特性是可行的,但是現(xiàn)有小麥面筋蛋白結構與功能資料積累還不能可靠地預測試驗結果。用編碼面包小麥HMW-GS的基因轉化其他面筋蛋白的野生型和突變株系,能夠分析特定 HMWGS的功能與結構特征,產生特性改變的株系。如缺乏D基因組的六倍體小黑麥 (X Triticosecale,2n=6x =42,AABBRR),排除了第 1部分同源染色體長臂上的 Glu-D1位點和短臂上的 Gli-D1及 Glu-D3位點,以及第 6部分同源染色體短臂上的 Gli-D2位點。將黑麥 (Secale cerealeLinn,RR)R基因組 (攜帶第 1部分同源染色體長臂上的 Sec-3位點和短臂上的 Sec-1位點,以及第 2部分同源染色體長臂上的Sec-2位點)移位到小黑麥,降低了小黑麥面包加工品質[43]。將面包小麥第 1部分同源染色體長臂移位到小黑麥第 1部分同源染色體長臂,以 Glu-D1d (亞基 5+10)等位基因代替 Sec-3位點,再進一步移位短臂上的 Gli-D1及 Glu-D3位點到小黑麥第1部分同源染色體短臂上,小黑麥品質有改善的趨勢,但面包加工品質變化不明顯[44]。開展這些工作有利于豐富麥類種質資源,為小麥粉加工過程中面筋調配提供原料。

我國食用小麥歷史悠久,饅頭、水餃、面條等蒸煮食品加工技術優(yōu)良、加工品種繁多,不足之處是需要進口面包和餅干小麥。我國小麥品種中 Gli-D1f、Gli-A2f、Gli-B2g及 Gli-D2g醇蛋白等位基因、Glu-1Bb(1Bx7+1By8)、Glu-1Bc(1Bx7+1By9)、Glu-D1a(1Dx2+1Dy12)HMW-GS等位基因 (或亞基)高頻率發(fā)生,缺乏歐美品種中高頻率發(fā)生的Gli-B2c、Gli-B1b、Gli-A2b、Glu-A1c(1Ax1+ 1Ay23)、Glu-D1d(1Dx5+1Dy10)等位基因[45-46],這有利于開展食品蒸煮與烘焙的機理研究。結合糧食界已確定的一系列小麥品質評價國家標準,如優(yōu)質小麥 -強筋小麥 (GB/T17892-1999)、優(yōu)質小麥-弱筋小麥 (GB/T17893-1999)、專用小麥品種品質(GB/T17320-1998)等,從種子儲藏蛋白與加工工藝角度,不斷完善這些國家標準及我國小麥品質的評價體系。

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Cereal Seed Storage Proteins:Structure, Property and Role in Grain Utilization

Li Xingjun
(Academy of the State Administration of Grains,Beijing 100037)

Storage proteins account for 50%of the total protein in mature cereal grains,and play role on grain nutrition for human and livestock and on grain properties relative with seed ger mination,grain storage and food pro2 cessing.The structures and properties of prolamin and globulin storage proteins of cereals and their mechanis ms of synthesis,transportation and deposition in the developing seeds are introduced.The role of gluten proteins ofwheat in deter mining bread making quality,and how to manipulate their amount and composition to change dough-mixing property is also demonstrated.This review is suggestive for cereal breeding,grain storage and grain processing quality valuation.

cereal,storage protein,prolamin,gluten,functional property,protein body

Q51 文獻標識碼:A 文章編號:1003-0174(2010)05-0105-10

國家糧科院科研業(yè)務費(ZX0708012),國家教育部留學歸國啟動基金(Z1006)

2009-05-20

李興軍,男,1971年出生,副研究員,博士,糧食生理生化