白毛夏枯草止咳化痰化學部位初步生物活性篩選

宋婷，劉守金，方成武，梁益敏，張鵬，李衛文

(安徽中醫學院藥學院中藥與資源實驗室，安徽省中藥現代化重點實驗室，安徽 合肥 230031)

*劉守金，E-mail：liushjin@hotmail.com

白毛夏枯草止咳化痰化學部位初步生物活性篩選

宋婷，劉守金*，方成武，梁益敏，張鵬，李衛文

(安徽中醫學院藥學院中藥與資源實驗室，安徽省中藥現代化重點實驗室，安徽 合肥230031)

目的初步確定中藥白毛夏枯草鎮咳、祛痰作用的成分。方法白毛夏枯草的提取物依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇進行萃取，得到3個部位。小鼠被灌胃給予石油醚部位2.1g·kg-1,醋酸乙酯部位1.47g·kg-1,正丁醇部位1.71g·kg-1，記錄濃氨水引起小鼠咳嗽的潛伏期和5min內的咳嗽次數。此外，計算小鼠呼吸道排出的酚紅量。同時，通過3個部位的HPLC圖譜的色譜峰平行比較其化學成分。結果3個部位中的醋酸乙酯部位能顯著延長潛伏期，減少咳嗽次數，同時增加酚紅的排出量。而且，木犀草素和芹菜素被證實存在在這個部位。結論白毛夏枯草醋酸乙酯部位有鎮咳、祛痰作用，其中含有的木犀草素和芹菜素可能是其中的2個活性成分。

鎮咳；祛痰；高效液相色譜

白毛夏枯草為唇形科筋骨草屬植物金瘡小草AjugadecumbensThunb.的干燥全草，又稱筋骨草；藥用始載于《本草拾遺》，具有清熱解毒，祛痰止咳，涼血止血的功效。用于治療肺熱咳嗽，咽喉腫痛，癰腫瘡癤等癥。白毛夏枯草的主要成分有黃酮類、二萜類、有機酸、酚性類等，現代藥理研究表明，白毛夏枯草具有鎮咳、祛痰、平喘[1-4]、抗炎、抑制支氣管病毒[5]、抗肺纖維化[6]、保肝利膽[7]，抑制I型變態反應和促進免疫作用[8]。現在以單味筋骨草部分粉碎、部分乙醇提取物，經混合而制成片劑和膠囊制劑，主要用于治療急慢性支氣管炎、肺膿瘍等癥，已經收載于《衛生部藥品標準·中藥成方制劑》第十九冊[9]。本實驗應用小鼠鎮咳、祛痰試驗對白毛夏枯草乙醇粗提物的石油醚、醋酸乙酯和正丁醇3個萃取部位進行藥效比較，結合高效液相色譜法對3個化學部位的色譜峰進行分析，以初步探討白毛夏枯草中起鎮咳、祛痰作用的有效化學部位，為進一步優化白毛夏枯草制劑生產工藝，提高質量控制水平，提供實驗依據。

1 材料與儀器

1.1試藥

可待因(青海制藥廠有限公司，30mg/片，批號20051002)；酚紅，分析純(上海展云化工有限公司，批號20080625)；木犀草素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號11520-200504)；芹菜素對照品(純度99.2%，本實驗室自制)；乙醇，石油醚，醋酸乙酯，正丁醇，氯化銨，氨水等實驗所用試劑均為國產分析純；白毛夏枯草藥材于2008年3月采自安徽合肥大蜀山，原植物由劉守金教授鑒定為唇形科筋骨草AjugadecumbensThunb.，憑證標本(HF080330)存于安徽中醫學院標本館(ACM)。

1.2動物

昆明種小鼠，體重18～22g，雌雄各半，由安徽省實驗動物中心提供，SPF級，合格證號：SCXK(皖)2005-001。

1.3儀器

島津LC-20AB型高效液相色譜儀，SPD-M20A型檢測器(日本島津公司)；島津LCSolutionN2010色譜工作站；KQ-50型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器廠)；UV752CRT型紫外可見分光光度計(上海棱光儀器公司)；402AI超聲霧化器(江蘇魚躍醫療責任有限公司)。

2 方法

2.1白毛夏枯草化學部位分離制備

白毛夏枯草藥材5250g，依次用95%乙醇、50%乙醇浸泡過夜，加熱回流提取，每個濃度提取2次，首次2h，第2次1h，合并提取液，回收乙醇，濃縮至膏狀無醇味，得到黑色稠狀物1633.12g，加入等量的水混勻，依次用石油醚(60～90℃)、醋酸乙酯以及正丁醇萃取，萃取液回收溶劑，并濃縮得到3個萃取部位。其中石油醚部位110.50g，醋酸乙酯部位77.22g，正丁醇部位89.60g，3個部位分別占藥材量的2.10%，1.47%，1.71%。

2.2藥效學考察

2.2.1鎮咳實驗[10]取昆明種小鼠,雌雄各半，隨機分成5組，分別灌胃給予生理鹽水20mL·kg-1、石油醚提取物2.1g·kg-1、醋酸乙酯提取物1.47g·kg-1、正丁醇提取物1.71g·kg-1和可待因50mg·kg-1，給藥30min后將小鼠放入600mL的玻璃瓶內，用402AI超聲霧化器向瓶內噴濃氨水30s，取出小鼠觀察并記錄小鼠咳嗽潛伏期和5min內的咳嗽次數。小鼠咳嗽表現為以其腹肌收縮，同時張大嘴為準。

2.2.2祛痰實驗[10]取昆明種小鼠，雌雄各半，隨機分成5組，分別灌胃給予生理鹽水20mL·kg-1、石油醚提取物2.1g·kg-1、醋酸乙酯提取物1.47g·kg-1、正丁醇提取物1.71g·kg-1和氯化銨1g·kg-1，30min后，分別給各小鼠腹腔注射5%酚紅10mL·kg-1，給予酚紅30min后頸椎脫臼處死小鼠，解剖小鼠，剝去氣管周圍組織，剪下自甲狀軟骨下至氣管分支處的一段氣管，放入盛有2mL生理鹽水的試管中再加1mol·L的NaOH0.1mL，搖勻放置2h，使氣管的色素溶出，用752型紫外可見分光光度計于波長546nm處測吸光度A值，根據酚紅標準液管的A值作出回歸方程，從而計算出酚紅排出量。

2.3HPLC指紋圖譜分析

2.3.1色譜條件BIOSILU546250-1型色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)；流動相采用二元體系：A為水，B為甲醇，梯度洗脫程序為0min(10%B)、20min(40%B)、30min(40%B)、40min(65%B)、50min(65%B)、60min(75%B)、70min(75%B)、80min(80%B)、90min(80%B)；柱溫：30℃；流速：1.0mL·min-1；檢測波長：336nm；進樣量：20μL。

2.3.2供試品溶液制備

2.3.2.1對照品溶液制備 精密稱取木犀草素對照品1.3mg、芹菜素對照品1.0mg，分別加入甲醇溶解，定容至10mL的容量瓶中，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取濾液，即得對照品溶液。

2.3.2.2化學部位溶液制備 取石油醚萃取部位浸膏6.47mg、醋酸乙酯萃取部位浸膏6.59mg和正丁醇萃取部位浸膏6.41mg，分別加入10mL甲醇，定容至10mL的容量瓶中，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取濾液，即得有效部位溶液。

3 結果

3.1白毛夏枯草3個化學部位的鎮咳作用比較

結果見表1。白毛夏枯草3個部位與模型組相比較，石油醚部位不能顯著延長小鼠咳嗽的潛伏期，減少咳嗽次數(與模型組相比P>0.05)，正丁醇部位只可以明顯減少小鼠的咳嗽次數(P<0.05)，而醋酸乙酯部位對濃氨水引起的小鼠咳嗽有明顯的抑制作用(P<0.05)。

表1 白毛夏枯草提取物對小鼠的鎮咳作用

注：(1)n=10；(2)與模型組相比,*P<0.01；(3)與醋酸乙酯提取物組相比，aP<0.05

3.2白毛夏枯草3個化學部位祛痰作用的比較

結果見表2。與模型組相比,石油醚與正丁醇部位對小鼠的酚紅排出量有所增加，經統計學分析，均沒有顯著差異(P>0.05)；醋酸乙酯部位能顯著增加酚紅排出量(P<0.05)，具有明顯的祛痰作用。

表2 白毛夏枯草提取物對小鼠的祛痰作用

注：(1)n=8；(2)與模型組相比,*P<0.05；(3)與醋酸乙酯提取物組相比，aP<0.05

3.3指紋圖譜比較

3.3.1化學部位HPLC圖譜比較 按照2.3.1的色譜條件進行分析，分別得到白毛夏枯草藥材石油醚萃取部位、醋酸乙酯萃取部位以及正丁醇萃取部位的指紋圖譜，結果見圖1～3。

圖1 白毛夏枯草石油醚萃取部位的HPLC圖

圖2 白毛夏枯草醋酸乙酯萃取部位的HPLC圖

圖3 白毛夏枯草正丁醇萃取部位的HPLC圖

由圖1～3可知，石油醚部位的色譜峰主要集中在40～50min以及60～80min，40～50min的色譜峰響應值在5左右，60～80min出現的色譜峰響應值在10左右；醋酸乙酯部位的色譜峰主要集中在40～50min，色譜峰響應值在100左右；正丁醇部位的色譜峰主要集中在20～50min，色譜峰響應值在50左右。

3.3.2對照品與醋酸乙酯萃取部位HPLC圖譜比較 見圖4。

圖4 木犀草素、芹菜素的HPLC圖譜

由圖4可知，醋酸乙酯萃取部位的色譜峰集中在40～50min，1號峰、2號峰為40～50min的兩個主要峰，保留時間分別為46.20min、48.90min。其中1號峰和2號峰分別為木犀草素和芹菜素。

4 討論

本實驗對白毛夏枯草的乙醇提取物進行有效部位研究，結果顯示白毛夏枯草乙醇提取物的石油醚、醋酸乙酯和正丁醇3個部位的HPLC指紋峰存在明顯的區別；小鼠的鎮咳、祛痰實作用實驗表明醋酸乙酯部位的鎮咳、祛痰作用顯著優于石油醚與正丁醇部位，提示白毛夏枯草乙醇提取物的醋酸乙酯部位可能為活性部位。

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PreliminaryBioactivity-screeningandCharacterizationofAnti-tussiveandExpectorantConstituentsofAjugaDecumbens

Song Ting, Liu Shoujin, Fang Chengwu, Liang Yimin, Zhang Peng, Li Weiwen

(LabofTraditionalChineseMedicineandresourceAnhuiUniversityofTraditionalChineseMedicine,College
ofpharmacy,AnhuiKeylabofmodernizationofTraditionalChineseMedicine,HefeiAnhui230031,China)

Objective: To identify potential anti-tussive and expectorant constituents ofAjugadecumbens, a traditional Chinese medicine.MethodsThree factions were separated with petroleum ether, ethyl acetate,

and n-butyl alcohol from crude alcohol extract of . The latency and frequency of coughs within min were counted in mice induced by ammonia water, after oral administration of the three factions at single doses of .g·kg, .g·kg, and .g·kg, respectively. Besides, amount of Phenol red secreted from respiratory tract was sampled. Meantime, the finger-prints of the three factions were profiled by HPLC to compare the chemical compositions in parallel. : Among the three factions, the ethyl acetate faction significantly elongated latency and cut down frequency, as well as to increase the secretion of phenol red. Moreover, luteolin and apigenin have been confirmed present in the active ethyl acetate faction. : The ethyl acetate faction of may exert effects, in which luteolin and apigenin were likely to be bio-active components.

Antitussis；Expectorant；High performance liquid chromatography

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