魚(yú)露發(fā)酵液中產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的篩選及其添加應(yīng)用*

黃紫燕，劉春花，羅婷婷，朱志偉，曾慶孝

1(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州，510640) 2(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島山東，266003)3(華南理工大學(xué) 工商管理學(xué)院，廣東 廣州，510640)

魚(yú)露發(fā)酵液中產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的篩選及其添加應(yīng)用*

黃紫燕1，劉春花2，羅婷婷3，朱志偉1，曾慶孝1

1(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州，510640) 2(中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島山東，266003)3(華南理工大學(xué) 工商管理學(xué)院，廣東 廣州，510640)

采用平板透明圈法初篩、搖瓶復(fù)篩，從半年魚(yú)露發(fā)酵液中篩選到1株產(chǎn)蛋白酶乳酸菌T1。考察其生理生化性質(zhì)、酶學(xué)特性，并加入魚(yú)露發(fā)酵液中進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。結(jié)果顯示:經(jīng)形態(tài)特征觀察，初步鑒別T1乳酸菌為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.);其最適生長(zhǎng)溫度為32℃，pH為5.5;所產(chǎn)蛋白酶酶活最適溫度為40℃，pH為7.0，最適條件下酶活力達(dá)72.2U/mL;添加T1乳酸菌發(fā)酵45 d，其TSN、AAN含量分別達(dá)到2.16 g/100mL和0.89 g/100mL，接近國(guó)家一級(jí)魚(yú)露標(biāo)準(zhǔn)，游離氨基酸總量為5 070.28 mg/100mL，比同期自然發(fā)酵增加了1.05倍。

魚(yú)露，蛋白酶，乳酸菌，應(yīng)用，分離純化

魚(yú)露是東南亞、日本以及我國(guó)南方沿海一帶人民喜愛(ài)的傳統(tǒng)調(diào)味品，其獨(dú)特的風(fēng)味是在釀造過(guò)程中，通過(guò)耐鹽性、嗜鹽性微生物和魚(yú)體自身所含的酶進(jìn)行發(fā)酵引起的一系列生化變化形成的［1］。我國(guó)魚(yú)露的生產(chǎn)需要2～3年的時(shí)間，生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，生產(chǎn)能力低，因此縮短發(fā)酵時(shí)間是急需解決的問(wèn)題。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于魚(yú)露的快速發(fā)酵工藝包括保溫法［2－4］、加曲法［5－7］、酶解［8］等物理、化學(xué)方面的加工工藝。但長(zhǎng)期保溫、添加蛋白酶均會(huì)增加生產(chǎn)成本，且風(fēng)味與傳統(tǒng)魚(yú)露差別較大，尚未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

乳酸菌是魚(yú)露發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌，可以產(chǎn)生有機(jī)酸、活性肽等物質(zhì)，其變化與魚(yú)露的各項(xiàng)理化指標(biāo)及游離氨基酸的變化有密切聯(lián)系［9］。在黃豆醬、醬油等發(fā)酵食品的實(shí)際生產(chǎn)中，一些工廠會(huì)在發(fā)酵期間加入乳酸菌，以加速發(fā)酵及增加其風(fēng)味物質(zhì)的形成［10］。已有從魚(yú)露中篩選產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的研究［11］，但少有利用這些乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵魚(yú)露的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)從發(fā)酵半年［9］的魚(yú)露發(fā)酵液中篩選出1株產(chǎn)蛋白酶、產(chǎn)酸的乳酸菌，對(duì)其生理生化特性及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，并添加鳀魚(yú)、海鹽混合物進(jìn)行發(fā)酵，其各項(xiàng)理化指標(biāo)均優(yōu)于魚(yú)露的自然發(fā)酵工藝，為應(yīng)用微生物加速魚(yú)露發(fā)酵提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

傳統(tǒng)發(fā)酵魚(yú)露樣品，以鳀魚(yú)(Engraulis japonicus)為原料，與30%(w/w)的海鹽混勻，在(30±5)℃下已自然發(fā)酵6個(gè)月，由廣東省汕頭魚(yú)露廠有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基及組成［12］

平板初篩培養(yǎng)基:TSA;復(fù)篩培養(yǎng)基:TSB;馴化培養(yǎng)基:TSB中添加一定量NaCl;斜面保藏培養(yǎng)基:MRS中添加1%CaCO3。

所有培養(yǎng)基配制后于1.03×105Pa下滅菌30 min。

1.3 產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的篩選

1.3.1 初篩

采用透明圈法［13］，將魚(yú)露發(fā)酵液用無(wú)菌生理鹽水稀釋至合適的濃度，選 10－4、10－5、10－63 個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度取0.1mL菌液涂布于初篩平板上，于37℃靜置培養(yǎng)36 h。產(chǎn)蛋白酶的乳酸菌菌落周圍產(chǎn)生透明圈，挑選透明圈較大的菌落，經(jīng)3次劃線分離、純化獲得純菌落。

1.3.2 復(fù)篩

將初篩的菌株接種于100mL復(fù)篩培養(yǎng)基中，于37℃、80 r/min搖床培48 h，測(cè)初篩菌株細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外的蛋白酶活性，選出產(chǎn)蛋白酶能力較高的菌株［14］。

1.3.3 馴化

將復(fù)篩出的菌株接種于300mL TSB中，于32℃、80 r/min搖床培養(yǎng)，第2天移取0.1mL菌液涂布于MRS中，分離后測(cè)定存活乳酸菌數(shù)，而后在原TSB菌液中加入9 g NaCl繼續(xù)搖床培養(yǎng)。共馴化7 d。

1.4 蛋白酶活力測(cè)定

蛋白酶活力定義:在最適反應(yīng)條件下，以酪蛋白為底物，每分鐘水解產(chǎn)生1μg酪氨酸，定義為1個(gè)活力單位(U)。蛋白酶活力測(cè)定按照SB/T 10317－1999執(zhí)行，每個(gè)樣品測(cè)3組平行樣。

1.5 菌株的初步鑒定與生理生化特征分析

按《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》、《乳酸細(xì)菌——基礎(chǔ)、技術(shù)和應(yīng)用》與微生物實(shí)驗(yàn)手冊(cè)進(jìn)行培養(yǎng)和生理生化特征的觀察。

1.6 添加發(fā)酵劑發(fā)酵魚(yú)露

將上文試驗(yàn)中篩選出的乳酸菌作為發(fā)酵劑添加入魚(yú)露發(fā)酵液中進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。向魚(yú)露中添加發(fā)酵劑的工藝以及實(shí)驗(yàn)流程如下:

鳀魚(yú)與30%的海鹽混勻，將鳀魚(yú)質(zhì)量5%的篩選出的乳酸菌培養(yǎng)液(107～108)離心，將沉淀菌體與鳀魚(yú)混勻，在(35±2)℃下發(fā)酵。同時(shí)以不添加篩出乳酸菌的鳀魚(yú)、海鹽混合物在同等條件下發(fā)酵，作為傳統(tǒng)魚(yú)露自然發(fā)酵的對(duì)照。在第1，5，15，30，45天時(shí)混勻取樣，過(guò)濾，濾液用于各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定。

1.7 魚(yú)露發(fā)酵液生化、理化指標(biāo)的測(cè)定

計(jì)數(shù)菌落總數(shù)采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基［15］;總可溶性氮(TSN)按照凱氏定氮法［16］測(cè)定;氨基酸態(tài)氮(AAN)按照甲醛滴定法［16］測(cè)定。揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)按照康維皿法(微量擴(kuò)散法)［17］測(cè)定;pH值按照 GB/T10786－1989方法用數(shù)字式 pH計(jì)(pHS-3C，上海精密科學(xué)儀器有限公司)測(cè)定;總酸按照GB/T 12456－1990測(cè)定。

所有的試驗(yàn)至少進(jìn)行3次，計(jì)算相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。指標(biāo)內(nèi)部的均值比較采用最小顯著差異法(least significant difference，LSD)，取 95% 置信度(P ＜0.05)。

1.8 游離氨基酸組成的測(cè)定

游離氨基酸的測(cè)定采用高效液相色譜法，采用Waters高效液相色譜儀和PICO.TAG氨基酸分析柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為38℃，流速為1mL/min。標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液為Sigma產(chǎn)品。

2 結(jié)果與討論

2.1 半年魚(yú)露發(fā)酵液乳酸菌的初篩及復(fù)篩結(jié)果

采用透明圈法，挑選透明圈較大的菌落，經(jīng)3次劃線分離、純化獲得純菌落。從發(fā)酵1年的魚(yú)露發(fā)酵液中篩選出產(chǎn)蛋白酶乳酸菌共22株，根據(jù)HR值(透明圈直徑與菌落直徑之比)的大小，選出HR值較大及菌落直徑較大的12株乳酸菌進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，測(cè)定搖床48 h后的酶活力、培養(yǎng)基pH值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 初篩出12株乳酸菌的形態(tài)及產(chǎn)蛋白酶酶活力

由表1知，初篩選出的12株菌為乳白色、灰色或黃色，大而平坦或小而厚，菌落濕潤(rùn)或干燥有皺褶，邊緣整齊，均具有乳酸菌的特征。除T6、T10菌株較小外，其他10株均為大而平坦。12株乳酸菌液體培養(yǎng)液中粗蛋白的蛋白酶活力在25.0～72.2 U/mL，具有顯著差異。從酶活力看，較優(yōu)的菌株為T(mén)1、T13、T5，雖然它們的HR值分別只有2.24，3.67和3.29，并不是最大的。這也表明根據(jù)HR值的大小來(lái)篩選產(chǎn)蛋白酶菌株不夠準(zhǔn)確，需要再進(jìn)一步測(cè)定酶活等指標(biāo)才能夠確定，與孫謐［18］等的研究相吻合。12株乳酸菌的液體培養(yǎng)基搖瓶48 h后pH值差距也較大，其中T1、T22、T4、T10四株pH值較低，從原pH值的7.20分別降低為6.49，6.06，6.39，6.02，產(chǎn)酸能力較其他菌株強(qiáng)。綜合比較，選擇T1乳酸菌作為魚(yú)露發(fā)酵的添加菌株。

2.2 T1菌株的生理生化特性及酶學(xué)性質(zhì)

由圖1可看出，T1乳酸菌在27～42℃穩(wěn)定性較好，其最適生長(zhǎng)溫度為32℃。在pH值5.0～6.0穩(wěn)定性較好，最適pH值為5.5。耐鹽性在10%以后急速下降，到15%時(shí)幾乎不能生長(zhǎng)，進(jìn)一步對(duì)耐鹽性進(jìn)行馴化后，鹽度為21%時(shí)活菌菌落數(shù)為32，對(duì)其進(jìn)行劃線分離純化。中國(guó)魚(yú)露一般在(35±5)℃的環(huán)境中發(fā)酵，平均pH值為6.15［19］，在 T1乳酸菌適應(yīng)的生長(zhǎng)環(huán)境范圍之內(nèi)，可見(jiàn)T1乳酸菌能在魚(yú)露發(fā)酵液中生存。

圖1 T1乳酸菌的最適溫度、pH值及耐鹽性

由圖2可看出，T1乳酸菌所產(chǎn)蛋白酶酶活力在30～60℃穩(wěn)定性較好，其最適溫度為40℃。在pH值5.0～8.0穩(wěn)定性較好，最適pH值為7.0。這與魚(yú)露生產(chǎn)過(guò)程發(fā)酵液的溫度、pH相吻合，T1乳酸菌所產(chǎn)蛋白酶能在魚(yú)露生產(chǎn)中發(fā)揮作用。該蛋白酶在最適條件下酶活力為72.2 U/mL。

圖2 T1乳酸菌所產(chǎn)蛋白酶的最適溫度及pH值

表2 T1乳酸菌的初步鑒定結(jié)果

根據(jù)《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》及《乳酸細(xì)菌—基礎(chǔ)、技術(shù)和應(yīng)用》常規(guī)鑒定，T1乳酸菌鏡下形態(tài)為產(chǎn)芽孢的直桿狀革蘭氏陽(yáng)性菌，接觸酶為陽(yáng)性，經(jīng)形態(tài)特征觀察，初步鑒定其為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)其他特征見(jiàn)表2。Hiroyuki等分別在越南魚(yú)露、日本魚(yú)露、韓國(guó)魚(yú)露中分離出 Bacillus sp.［20－22］，從 Bacillus sp.培養(yǎng)基表面提純的蛋白酶表現(xiàn)出較大活性，能降解酪蛋白產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的氨基酸片段，特別是Asn，Gly，Val，Ile 等游離氨基酸。

2.3 添加T1進(jìn)行魚(yú)露發(fā)酵結(jié)果

添加T1菌進(jìn)行魚(yú)露發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液的TSN、AAN、TVB-N、pH、菌落總數(shù)、總酸的變化如圖3～圖5所示。

圖3 TVB-N含量、菌落總數(shù)的變化

圖4 pH值、總酸含量的變化

由圖3可見(jiàn)，添加T1乳酸菌的發(fā)酵液中菌落總數(shù)較高，在添加初期其對(duì)數(shù)值達(dá)到7.32，可見(jiàn)經(jīng)馴化后T1乳酸菌能在魚(yú)露中生存。而后菌落總數(shù)緩慢下降，但其對(duì)數(shù)值維持在7.0左右。TVB-N是衡量魚(yú)露腐敗變質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，原因是發(fā)酵過(guò)程中腐敗微生物的生長(zhǎng)，將蛋白質(zhì)分解成氨基酸后，再進(jìn)一步分解為氨、三甲胺等揮發(fā)性鹽基含氮化合物［23］。圖3顯示，添加T1發(fā)酵液的TVB-N含量較自然發(fā)酵發(fā)酵液中的大，尤其在發(fā)酵前5d增長(zhǎng)迅速，而后較為緩慢。在發(fā)酵45d時(shí)TVB-N已達(dá)到109.8g/100mL，而自然發(fā)酵僅為57.0g/100mL。

當(dāng)部分蛋白質(zhì)被分解為揮發(fā)性鹽基氮時(shí)，會(huì)使pH值大幅度上升，故添加T1的發(fā)酵液中pH值較高，但隨著乳酸菌的發(fā)酵，pH值不斷減少。低pH值能促進(jìn)酵母菌的大量繁殖，其與乳酸菌菌體之間引起競(jìng)爭(zhēng)進(jìn)行酒精發(fā)酵，生成乙醇，進(jìn)而能在后期發(fā)酵中促進(jìn)魚(yú)露中各種香氣成分的生成［24］。添加T1乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵的發(fā)酵液中總酸(以乳酸計(jì))含量明顯較高，這是由于乳酸菌作用使鳀魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中生成揮發(fā)性的有機(jī)酸。總酸的變化與pH值變化基本相反，添加T1發(fā)酵液中總酸含量比自然發(fā)酵的高出51.97%，從圖4增長(zhǎng)趨勢(shì)看，差值會(huì)繼續(xù)增大。T1乳酸菌有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力。

乳酸菌分泌的蛋白酶能使蛋白質(zhì)水解成為多肽、氨基酸等，為后階段其他微生物的生長(zhǎng)創(chuàng)造條件，這也是魚(yú)露分級(jí)的重要標(biāo)準(zhǔn)。圖5顯示，添加T1菌的發(fā)酵液中TSN、AAN含量明顯較高，證明了魚(yú)露發(fā)酵過(guò)程中，乳酸菌有助于蛋白質(zhì)的分解，所分離出的T1對(duì)加強(qiáng)蛋白質(zhì)的水解是有效的。發(fā)酵45 d時(shí)，添加T1的發(fā)酵液中TSN含量為2.16 g/100mL，已經(jīng)超過(guò)國(guó)家一級(jí)魚(yú)露標(biāo)準(zhǔn)中TSN含量的規(guī)定(≥1.2 g/100mL)，AAN含量為0.89 g/100mL，接近國(guó)家一級(jí)魚(yú)露標(biāo)準(zhǔn)中的規(guī)定(≥0.9 g/100mL)［25］。但蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率僅為41.2%，蛋白質(zhì)還需進(jìn)一步降解。添加T1的發(fā)酵液中AAN含量在45d時(shí)增長(zhǎng)趨勢(shì)較TSN大，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率會(huì)逐漸增大。

圖5 TSN、AAN含量的變化

2.4 游離氨基酸組成與含量

魚(yú)露中游離氨基酸總量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加。游離氨基酸組成與含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3，發(fā)酵45 d時(shí)游離氨基酸總量為2 476.8 mg/100 g，而添加T1乳酸菌的發(fā)酵液中為5 070.28 mg/100 g，增加了1.05倍，接近于自然發(fā)酵3年的產(chǎn)品的含量5 705.79 mg/100 g。在發(fā)酵初期添加了有益乳酸菌，分泌出的蛋白酶使原料魚(yú)加速發(fā)酵，45 d基本完成水解。Leu，Try，Phe，Arg，Lys，Val，Ile 等必須氨基酸及 Ala，Asp，Gly 等增長(zhǎng)較為明顯，其中 Asp，Gly，Val，Ile 4種氨基酸的增加同Hiroyuki等人提及的Bacillus sp.降解功能相吻合。但鮮味氨基酸谷氨酸含量的增長(zhǎng)量較少，發(fā)酵液還需進(jìn)一步發(fā)酵，以促進(jìn)風(fēng)味和滋味物質(zhì)的形成。

表3 游離氨基酸的組成與含量 mg/100 g

3 結(jié)論

(1)用透明圈法從魚(yú)露半年發(fā)酵液中共篩選出22株產(chǎn)蛋白酶乳酸菌，選出透明圈較大的12株進(jìn)行復(fù)篩，其中T1乳酸菌雖然HR不是最高，僅為2.24，但其所產(chǎn)蛋白酶酶活力最大，為72.2 U/mL，且搖瓶48 h后液體培養(yǎng)基pH降低了0.71，產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，選取T1菌株為目標(biāo)菌。

(2)T1乳酸菌在27～42℃穩(wěn)定性較好，其最適生長(zhǎng)溫度為32℃;在pH值5.0～6.0穩(wěn)定性較好，最適pH值為5.5;經(jīng)過(guò)馴化耐鹽性達(dá)到21%。其酶學(xué)特性為:酶活力在30～60℃穩(wěn)定性較好，其最適溫度為40℃;在pH值5.0～8.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，最適pH值為7.0。T1乳酸菌能在魚(yú)露中生存并發(fā)揮作用。初步鑒定T1乳酸菌為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)。

(3)將T1乳酸菌添加到鳀魚(yú)與海鹽的混合物中發(fā)酵，發(fā)酵第45d時(shí)發(fā)酵液中TSN、AAN含量分別為2.16 g/100mL和0.89 g/100mL，接近國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)一級(jí)魚(yú)露的規(guī)定;游離氨基酸總量為5 070.28 mg/100 g，比自然發(fā)酵45d的發(fā)酵液中含量增加了1.05倍。添加T1乳酸菌對(duì)魚(yú)露的快速發(fā)酵有著積極的貢獻(xiàn)。

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Screening of Proteinase-producing Lactic Acid Bacteria from Fish Sauce and the Application

Huang Zi-yan1，Liu Chun-hua2，Luo Ting-ting3，Zhu Zhi-wei1，Zeng Qing-xiao1
1(College of Light Industry and Food Science，SCUT，Guangzhou 510640，China)2(College of Food Science and Technology，OUCQ，Qingdao 266003，China)3(School of Business Administration，SCUT，Guangzhou 510640，China)

In order to find useful microorganisms that accelerate fish sauce fermentation，we used the method of transparent circle and shaking culture and isolated a proteinase producing Lactic acid bacteria T1 from 6－monthfermented fish sauce.We investigated the proteinase＇s physiological and biochemical properties，enzymatic properties and add it to fish sauce for fermentation test.The results showed:the optimum growth temperature of T1 was 32℃，pH was 5.5;the optimum temperature of proteinase was 40℃，pH was 7.0，the enzyme activity reached 72.2 U/mL;preliminary identified T1 was Bacillus sp.T1 played a positive contribution to the accelerated of fish sauce fermentation.After fermented for 45 days T1 was added to raw material of fish sauce，the contents of TSN and AAN were 2.16 g/100mL and 0.89g/100mL which is close to the national standard of A grade fish sauce.The contents of free amino acid increased 1.05 times to 5 070.28 mg/100g.

fish sauce，proteinase，Lactic acid bacteria，application，isolation and purification

碩士研究生(曾慶孝教授為通訊作者)。

*廣東省科學(xué)技術(shù)廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)計(jì)劃(2007A020100001－8);廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)項(xiàng)目(A200899103)

2010－06－07，改回日期:2010－09－10