稀釋率對短乳桿菌NCL912連續培養產γ-氨基丁酸的影響

仇婷，李海星，曹郁生

(食品科學教育部重點實驗室南昌大學中德聯合研究院，江西南昌，330047)

稀釋率對短乳桿菌NCL912連續培養產γ-氨基丁酸的影響

仇婷，李海星，曹郁生

(食品科學教育部重點實驗室南昌大學中德聯合研究院，江西南昌，330047)

建立了短乳桿菌(Lactobacillus brevis)NCL912連續培養生產γ-氨基丁酸的方法。在32℃、pH 5.0、150 r/min 條件下，通過考察不同稀釋率(0.06 h－1、0.08 h－1、0.10 h－1、0.12 h－1和 0.14 h－1)時，連續培養體系中菌體濃度、葡萄糖利用和GABA產量3項指標的變化，研究了稀釋率對連續培養的影響。結果表明，當稀釋率為0.06 h－1和 0.14 h－1時，培養不能達到穩態;當稀釋率為 0.08 h－1、0.01 h－1及 0.12 h－1時，反應體系均能進入穩態。在考察的幾個稀釋率中，0.10 h－1最好。

短乳桿菌NCL912，連續培養，稀釋率，γ－氨基丁酸

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一種天然存在的非蛋白氨基酸，廣泛分布于動植物體內［1］。GABA是哺乳動物中樞神經系統的一種重要抑制性神經遞質，具有重要的生理功能［2－7］。

GABA的制備有化學合成法和微生物合成法。相比而言，化學合成法成本高、安全性差;而微生物發酵生產GABA是一種安全、高效、低成本的方法。細菌、酵母以及真菌［8～11］均能發酵生產GABA。其中乳酸菌生產的GABA及其菌體均能直接應用于食品、醫藥等領域，這就大大增加了其研究開發的意義。利用乳酸菌發酵生產GABA在國內外均有報道［12－17］。但所采用的均是分批發酵技術，目前尚未見有關乳酸菌連續發酵生產GABA的報道。微生物的連續培養(continuous culture)是相對于分批培養而言的。與分批發酵相比，連續培養有其特有的優點，如不需要分批發酵的間隔準備工作，可連續生產，微生物能夠維持一個動態的平衡等。因而在動植物細胞和微生物的培養，微生物的生理生化研究，細胞和代謝產物的生產等方面有著廣泛應用。

本實驗室在前期工作中，篩選出1株高產GABA的短乳桿菌(Lactobacillus brevis)NCL912［18］，并對其分批發酵合成GABA的工藝進行了研究，確定了分批培養的發酵條件［19］。進一步對短乳桿菌 NCL912連續培養產GABA進行了初步的研究，成功組建了連續培養系統;研究了不同稀釋率(dilution rate，D)對乳酸菌連續培養體系的影響，探討了連續培養技術在GABA生產中的應用。

1 實驗材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司;高速冷凍離心機，Sigma公司;pH電極，蘇州市漢星電化學有限公司;pH控制儀，日本東京B.E.Marubishi有限公司;79－1型磁力攪拌器，上海儀表(集團)供銷公司;蠕動泵，蘭格恒流泵有限公司;溫度控制系統為自己組裝，水缸、可控溫加熱棒等購自市場。

實驗所用試劑均為國產分析純。

1.2 菌種與培養基

菌種:短乳桿菌(Lactobacillus brevis)NCL912，高產GABA，由本實驗室從泡菜中分離并保存［18］。

種子培養基:葡萄糖，25g/L;酵母浸粉，6.25g/L;大豆蛋白胨，6.25g/L;MnSO4·4H2O，0.05g/L;MSG，0.15mol/L;吐溫80，2mL/L，用2mol/L H2SO4調pH值為5.0，高壓滅菌。

連續培養培養基:葡萄糖，30g/L;酵母浸粉，12.5g/L;大豆蛋白胨，12.5g/L;MnSO4·4H2O，0.05g/L;MSG，0.5mol/L;吐溫 80，2mL/L。培養基的氮源，MSG，以及其他成分分別高壓滅菌，121℃，20min，然后混合備用。

1.3 種子活化方法

取保藏菌種接種于5mL種子培養基中，32℃靜置培養24 h。按此方法活化2次后，以5%的接種量轉接于100mL種子培養基，32℃、150 r/min振蕩培養10 h，即為種子培養物。

1.4 連續培養裝置圖與操作方法

連續培養實驗裝置如圖1所示。

圖1 連續培養裝置簡圖

反應器為800mL玻璃罐，工作體積設定為400mL。組裝系統并配制培養基，滅菌后，打開蠕動泵往反應器內流加360mL已混合的發酵培養基，用注射器接種40mL種子培養物，pH用pH控制儀自動控制。經過10 h培養，打開蠕動泵以一定稀釋率向反應器內流加培養基，開始連續培養。連續培養條件如下:培養溫度32℃;攪拌速度150 r/min;pH 5.0，用2mol/L H2SO4溶液自動調控。實驗選取5種不同的稀釋率，分別為 0.06 h－1、0.08 h－1、0.10 h－1、0.12 h－1及0.14 h－1。每12 h取樣，測定培養液中的菌體濃度、GABA濃度及殘糖濃度。

1.5 培養液樣品相關參數檢測

菌體濃度:樣品稀釋5倍后，使用紫外分光光度計測定樣品在600 nm波長下的吸光值(A600)。GABA濃度:采用預染紙色譜法測定［20］。殘糖濃度:采用3，5-二硝基水楊酸法(DNS)測定。

1.6 連續培養穩態的確定

連續培養進行60 h后，連續3次取樣分析，如測定的3種參數指標的波動范圍在5%以內，可認為連續培養已經進入穩態。本實驗主要依據菌體濃度、GABA濃度及葡萄糖濃度的檢測結果，確定連續培養系統是否達到穩態。

1.7 數據分析

本實驗數據均采用軟件Sigma Plot 10.0分析。

2 結果與討論

2.1 稀釋率對乳酸菌連續培養穩態建立的影響

本實驗研究了在不同稀釋率情況下，乳酸菌連續培養系統運行狀況，實驗結果如圖2～圖6所示。由圖2可知，為當稀釋率為0.06 h－1時，在前36 h反應體系中葡萄糖含量急劇下降，導致隨后培養過程中菌體濃度下降，且GABA濃度不能保持穩定。說明當D=0.06 h－1時，培養基補給速度小于消耗速度，營養不足以維持菌體的生長，致使菌體大量死亡，培養不能進入穩態。圖3、圖4及圖5表明，當稀釋率為分別 0.08 h－1、0.10 h－1和 0.12 h－1時，在培養進行到60 h后，反應體系中菌體、GABA濃度及葡萄糖濃度均能在一定水平維持穩定，整個系統達到穩定狀態。由圖6可知，當稀釋率為0.14 h－1時，隨著發酵的進行，反應體系中的菌體濃度逐步下降，GABA濃度及葡萄糖濃度有比較大的波動。說明當D=0.14 h－1時，發酵液稀釋速率大于菌體增殖速率，菌體不斷被洗出，0.14 h－1已接近臨界稀釋率DC(相當于最大比生長速率μmax時的D值)。

圖2 稀釋率0.06 h－1時菌體、GABA和葡萄糖的變化

圖3 稀釋率0.08 h－1時菌體、GABA和葡萄糖的變化

圖4 稀釋率0.10 h－1時菌體、GABA和葡萄糖的變化

圖5 稀釋率0.12 h－1時菌體、GABA和葡萄糖的變化

圖6 稀釋率0.14 h－1時菌體、GABA和葡萄糖的變化

2.2 稀釋率對GABA濃度、葡萄糖濃度及GABA產率的影響

當系統達到穩態時，不同稀釋率情況下連續培養體系中GABA濃度、葡萄糖濃度及GABA產率如表1所示。

由圖7(A)可知，隨著稀釋率的增大，GABA濃度逐漸降低。GABA濃度在D=0.01 h－1時比D=0.08 h－1時低 9.97%，在 D=0.12 h－1時比 D=0.10 h－1時低14.65%。由圖7(B)可知，當稀釋率分別為0.08 h－1和0.10 h－1時，反應體系中殘余葡萄糖濃度均比較低，分別為0.756 5±0.102 3g/L、1.039 7±0.071 3g/L;當稀釋率為0.12 h－1時，殘糖濃度大幅增加為16.283 1±0.414 5g/L。說明低稀釋率(0.08、0.10 h－1)利于菌體對葡萄糖的充分利用，而高稀釋率(0.12 h－1)則會造成大量浪費。由圖7(C)可知，GABA產率隨稀釋率的增大而增加，在D=0.10 h－1時比 D=0.08 h－1時高12.53%，D=0.12 h－1時比 D=0.10 h－1時高2.41%，GABA產率的增加幅度隨稀釋率的增大而減小，說明高稀釋率(D=0.12 h－1)不利于菌體充分發酵生產GABA。綜合GABA產率和葡萄糖剩余2個因素，短乳桿菌NCL912連續培養生產GABA選取0.10 h－1的稀釋率較為合適。

表1 短乳桿菌NCL912連續培養結果

圖7 稀釋率對GABA濃度(A)、葡萄糖濃度(B)及GABA產率(C)的影響

3 結論

本研究成功建立了短乳桿菌NCL912連續培養生產GABA的方法，并以連續培養中菌體濃度、葡萄糖利用和GABA產量為指標，考察了不同稀釋率對連續培養的影響。當稀釋率為0.06 h－1和0.12 h－1時，培養不能達到穩態，而當稀釋率為 0.08 h－1、0.01 h－1及0.12 h－1時，反應體系均能進入穩態。隨著稀釋率的增大，穩態時GABA的產量下降，而產率升高。稀釋率為0.08 h－1和0.10 h－1時，發酵液中殘糖濃度比較低，菌體對營養的利用比較充分;當稀釋率增大為0.12 h－1時，發酵液中則有(16.283 1±0.414 5)g/L葡萄糖殘余。實驗結果表明，對短乳桿菌NCL912進行連續培養，能夠實現GABA的高效連續生產。

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Effect of Dilution Rate on γ-Aminobutyric Acid Production by Continuous Culture of Lactobacillus brevis NCL912

Qiu Ting，Li Hai-xing，Cao Yu-sheng
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Sino-Geman Joint Research Institute，Nanchang University，Nanchang 330047，China)

A continuous culture method of Lactobacillus brevis NCL912 was developed for production of γ－aminobutyric acid.The effects of the dilution rate on the biomass，residual glucose and GABA yielding of the continuous culture were investigated.The results indicated that dilution rate had a significant effect on the cell proliferation and GABA production.Steady state could not be obtained when dilution rates were 0.06 h－1or 0.14 h－1.When dilution rates were 0.08 h－1，0.10 h－1or 0.12 h－1，the culture system could reach the steady states.Among the dilution rates tested，0.10 h－1was the best one for the GABA continuous production.

Lactobacillus brevis NCL912，continuous culture，dilution rate，γ-aminobutyric acid

碩士研究生(曹郁生教授為通訊作者)。

2010－07－15，改回日期:2010－10－12