電容法在線活細胞量傳感器在黑曲霉帶渣發酵生產檸檬酸中的應用*

劉玉偉，黃明志，周勇，張繼學，楊儒文，馮志菲，常雷，趙親虎

1(國家生化工程技術研究中心(上海)，上海，200237)2(安徽豐原生物化學股份有限公司，安徽蚌埠，233010)

電容法在線活細胞量傳感器在黑曲霉帶渣發酵生產檸檬酸中的應用*

劉玉偉1，黃明志1，周勇2，張繼學2，楊儒文2，馮志菲2，常雷2，趙親虎2

1(國家生化工程技術研究中心(上海)，上海，200237)2(安徽豐原生物化學股份有限公司，安徽蚌埠，233010)

以黑曲霉帶渣發酵生產檸檬酸的培養過程為對象，探討了用電容法在線活細胞量傳感器測量復合培養基中可結團絲狀菌的活細胞量的可能性。通過實驗確定了儀器的最佳分析條件:低通濾波值為60，測定頻率為雙頻(580，10 085 kHz)。實驗結果表明，電容法活細胞量傳感器的電容值與活細胞量之間有著較好的線性對應關系，其線性相關系數為0.994。在發酵培養液采用帶渣發酵的情況下，考察了在線活細胞電容值與常規的離線測定菌濃方法，如細胞干重、波長600nm處吸光度OD600和菌體離心體積之間的關系結果表明，在0～20 h，各離線參數與電容值之間的線性相關系數最好的僅為0.91。同時利用在線活細胞傳感器的電容值能較好地估計出比生長速率，比通過在線間接參數OUR、CER估計更準確。因此，電容傳感器為黑曲酶帶渣發酵提供了一個可靠的工具。

在線活細胞量傳感器，電容值，黑曲霉，復合培養基，帶渣發酵

大量活細胞的存在是生物過程得以持續進行的前提條件，長期以來人們一直試圖檢測生物過程中細胞的濃度，以了解細胞生長狀況，考察細胞生長與基質消耗及產物形成的關系。傳統的測量方法是通過手工取樣離線測定，比如測定干重(DCW)、吸光度(OD600)和離心體積(PMV)等。這些離線測定方法操作復雜，滯后時間長，測定結果是“活”細胞和“死”細胞的總和。常用的基于比濁法的細胞濃度傳感器盡管可在線檢測細胞濃度，但也存在諸多不足，如無法克服培養基中固體成分的干擾，無法區分死細胞和活細胞，容易受細胞大小影響等，在實際應用中存在較大誤差。為了解決這些問題，近年來提出了多個基于不同測定原理的在線細胞量測量方法，如近紅外光譜法［1］、電阻光譜法［2］和電容法是［3］，其中電容法根據活細胞具有密閉的細胞膜系統的特點，在交變電場作用下活細胞內帶電細胞質遷移，使活細胞成為極化細胞，形成電容，根據測得的電容大小可計算出活細胞的量。基于電容法的活細胞量測量已在多個生物過程中得到成功應用，如酵母菌［4－5］、鏈霉菌［6］和CHO［7］等。檸檬酸發酵過程中產物的形成與黑曲霉菌細胞的生長密切相關，活細胞量的精確測量非常重要，但由于培養基中水不溶性物質的存在，長期以來這個問題一直難以解決，尚未見到可在線測量檸檬酸發酵過程中活細胞量的報道。本論文將基于原生質電容法的在線活細胞量傳感器應用到檸檬酸發酵過程中，探討帶渣發酵過程中活細胞量的測定方法。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉(Aspergillus niger)C0827，安徽豐原生化提供。

1.2 培養基和發酵條件

1.2.1 培養基

種子培養基:玉米粉15%，pH值5.8(用Ca(OH)2調制)。發酵培養基:玉米粉25%，尿素0.02%，pH 5.6～5.8(用Ca(OH)2調)。

1.2.2 培養條件

種子罐培養條件:溫度36℃，通氣量1.2VVM，罐壓0.07 MPa，攪拌轉速350 r/min。

發酵罐培養條件:溫度37℃，通氣量1.1VVM，罐壓0.07 MPa，攪拌轉速350 r/min。

1.3 離線參數分析方法

干重測量:通過將40mL的發酵液用濾紙進行過濾，再用清水清洗2次，直至洗掉發酵液中的殘糖，然后將濾紙連同固體一起放到80℃烘箱中烘至恒重。

OD600測量:通過發酵過程中取得的發酵液經適當倍數稀釋后在波長600 nm下的吸光值。

PMV測量:通過將10mL的發酵液用10mL離心管離心，測定離心后固體體積的百分數。

檸檬酸的測定:用0.142 9mol/L NaOH溶液中和滴定(酚酞指示劑)。

總糖的測定:采用菲林試劑法。

1.4 在線參數分析

活細胞量分析:采用Biomass Monitor 220(Aber，UK)檢測發酵過程中活細胞濃度。將電極插到30L發酵罐中，121℃滅菌消毒后，電容和電導可同時被測量出來。該儀器能夠采用多頻率測量，測量的電容范圍在0.1～10 MHz，電導范圍為1～100 ms/cm。測量原理為通過探頭發射電脈沖信號，在探頭周圍形成一個電磁場。活細胞有一個緊湊閉合的細胞膜，在電磁場下可被看作獨立的小電容器。在電磁場作用下，活細胞被極化，細胞膜周圍的電荷上升，這個電容變化值被準確檢測出來，而死細胞(細胞膜破裂)、氣泡、細胞碎片以及固體培養基顆粒(如玉米粉/黃豆餅粉等)或微載體顆粒等因不能形成密閉的電容，不會被檢測到，因此電容電極測得的信號值只與發酵罐中活細胞量的值有一定的相關性。

氣體成分分析:發酵過程進氣和排氣中O2和CO2濃度通過過程質譜儀MAX-300 LG(Extrel，USA)獲得，將所獲得的在線尾氣數據通過生物過程軟件“發酵之星”(華東理工大學)進行處理，在線計算出O2消耗速率OUR，CO2釋放速率CER和呼吸商RQ。

2 結果和討論

2.1 分析條件優化

電容法在線活細胞傳感器在黑曲霉菌帶渣發酵過程的使用還未見報道，需要考察外部條件對儀器性能的影響，特別是低通濾波值和測量頻率對基線噪聲和漂移性能的影響，以確定儀器的最佳使用條件。按照儀器的使用說明，將低通濾波值設為1，把發酵罐攪拌和通風開到最小或關掉，觀察此時的電容基線和噪音大小，然后根據觀察到的基線噪聲，將低通濾波值大小設定為10，如果信號噪音強度還是大，那么就需要繼續增大低通濾波值，直到噪音強度合適。低通濾波值可在1～100之間設定，過大和過小的低通濾波值都不能得到穩定的測量結果。考慮到檸檬酸發酵用培養基的水不溶性物質較多以及通風量較大，可能會造成較大的基線噪聲，因此分別把低通濾波值設為30、45和60，觀察測定結果，發現低通濾波值為60時能取得較好的效果。同時，測量頻率設定為多頻或者低頻，會對測定結果產生較大的影響。在低通濾波值固定為60的情況下，考察了測量頻率對儀器的影響，分別將頻率設為單頻580 kHz以及雙頻580 kHz和10 085 kHz。單頻測量時不考慮背景電容的影響，而雙頻的高頻率測量值相當于培養基的背景電容，儀器能自動地從低頻率電容減去高頻率電容。發酵過程中儀器在優化前(單頻)和優化后(雙頻)的測量曲線如圖1所示。從圖1可看出，用單頻測量電容曲線上下波動幅度較大，無法正確判斷細胞的變化情況，而用雙頻測量的曲線變化平緩，能夠很好地反映發酵過程中黑曲霉菌的菌團個體增大的過程。因此，對于黑曲霉帶渣發酵，最優的測定條件為低通濾波值為60，頻率為雙頻580 kHz和10 085 kHz。

圖1 黑曲霉菌帶渣發酵傳感器最優條件

2.2 電容值與活細胞量之間的對應關系

要得到活細胞傳感器測量出的電容值與活細胞量之間的對應關系，首先要知道活細胞量的確切值，但對于黑曲霉這種在發酵過程中會結團的細胞來說，常用的菌落計數和血小板計數等方法都不能使用，尚沒有其他辦法能直接測出活細胞的量，為此，本文設計實驗將玉米粉進行液化后過濾，除去玉米渣，把黑曲霉接種在過濾清液中進行培養，在4～20 h的對數生長期內分別取樣，離線測量細胞干重，結果如表1所示。對數生長期內的細胞活力旺盛，可看作都是活細胞，而且發酵液中不含有其他固體顆粒，因此，此時的細胞干重大小可直接反映活細胞量的多少。將離線測量的細胞干重與在線檢測的電容值進行線性回歸，得到方程1，其相關系數為0.994。可見在考察的范圍內，活細胞傳感器測量出的電容值能準確地反應發酵過程中活細胞量的變化。

表1 培養基為過濾清液時菌體干重與電容的關系

2.3 電容值與各種離線測定值之間的比較

為了探討黑曲霉菌帶渣發酵中活細胞量的最佳測量方法，比較了電容在線測定法與3種離線測定方法，結果如圖2所示。盡管所有的離線測定方法目前都被廣泛使用，但是它們都各有缺點。OD、PMV、干重(DCW)通常用來估計總的菌體濃度，PMV法，因為它的簡單易于操作，在醫藥領域被廣泛用于菌體濃度的測量，然而培養基配方和細胞形態的改變，使這種測定方法變得不可靠。細胞干重在一定條件下能很好地反映細胞量，但在一些發酵過程中有的發酵液組分會粘附在細胞表面，即使用去離子水沖洗也不能完全洗掉，導致測量出的細胞干重比實際的細胞量要大，同時，檸檬酸發酵培養基中含有玉米渣，取樣時玉米渣并沒有完全被菌體利用，因此離線測定的細胞干重包含了沒有被菌體利用的渣子以及死的細胞。而電容在線測定法中，電容值只與活細胞量有關，與玉米渣的多少沒有關系，死的細胞對電容值也沒有影響，是最可靠、最有效的活細胞量測定方法。對各種離線測定值與在線電容之間的關系進行了擬合，它們都沒有很好的線性關系，線性最好的PMV與在線電容間的線性相關系數也僅為0.91。如果儀器的穩定性不高，每一次測量的電容結果有較大差異，則很難解釋發酵過程的現象。為此，考察了活細胞量傳感器在不同批次發酵過程中測量結果的重復性。在相同的菌種、培養基組成及操作條件下，比較了3批發酵過程中記錄的電容測量值，它們之間具有較好的重復性(見圖2)，因此該傳感器能夠為黑曲霉帶渣發酵生產檸檬酸過程提供穩定可靠的活細胞量信息。

圖2 在線電容法與各種離線測定菌濃法的比較

2.4 比生長速率在線估計

比生長速率的控制在發酵過程中有著重要的意義，很多種微生物只有在一定的比生長速率下才能高效生產出特定產物，但由于細胞量在線測定技術的不完善，目前比生長速率大多根據離線菌體濃度進行計算，滯后時間長，很難實際應用。本文嘗試運用在線電容值來進行比生長速率的在線估計，比較了其與基于過程質譜儀測定的尾氣數據計算出的OUR和CER進行估計的方法的優劣。

基于電容測定值的比生長速率可通過式(2)計算:

式中a為菌濃與電容之間的系數，為常數，可以消除。將Cap對t在半對數坐標上作圖，直線的斜率即為μ。對批培養操作在半對數坐標上為一曲線，曲線某點的切線斜率即可近似為該點的μ值。同理，生物過程中OUR、CER和菌量存在一定的關系，OUR(CER)=X Q，假設活細胞的呼吸強度Q是一樣的，那么OUR、CER和活細胞量之間也存在正比關系，比生長速率分別表示為式(3)和式(4)來計算。

在發酵過程中，分別基于電容、OUR和CER進行估計的比生長速率的變化如圖4所示。，總體上來看，3種估計方法都能大體上反映出比生長速率由高到低的變化趨勢，但從電容值估計出的比生長速率值可更真實地反映菌體的生長狀態:在20 h之前，發酵過程處于對數生長期，比生長速率較大且波動平緩，20 h后，菌體生長處于穩定期，比生長速率維持在零左右。而從過程質譜儀測定的尾氣數據計算出的OUR和CER進行估計的比生長速率的值變化較大，究其原因，盡管過程質譜儀分析的精度很高，計算出的OUR和CER的值的可信度也高，但由于不同代謝狀態的細胞可能有著不同的呼吸強度，導致式(3)和式(4)的假設不能嚴格成立，從而引起了估算出來的比生長速率值的可信度降低。因此，從在線電容值估計的比生長速率可在今后的發酵過程在線控制中直接應用，可為發酵過程提出更精細的控制策略。

2.5 結合在線活細胞量的檸檬酸發酵過程參數分析

圖5顯示了黑曲霉帶渣發酵過程參數的變化趨勢，發酵罐接種后，幾乎沒有延遲期，很快進入了指數生長期，菌體利用葡萄糖作碳源，消耗 O2并放出CO2。隨著菌體的生長，耗氧率增大，CO2釋放率都明顯地同步增加，到了6 h左右兩者變化比較平緩，而后耗氧率保持平穩的增大，CO2釋放率卻下降很快，這是因為，此時菌體生長過程中釋放的CO2進行羧化形成草酰乙酸進而合成檸檬酸，此時檸檬酸合成較快。16 h后菌體達到穩定期，耗氧率和CO2放率變化不大，都趨于平穩，呼吸商也穩定。到了54 h以后，菌活力下降，電容值呈下降趨勢，耗氧率也隨之降低，CO2釋放率增大，導致RQ的陡升。說明這時菌體活力下降，引起耗氧率降低，發酵過程中形成的CO2不再進行羧化而被大量釋放出來，造成途徑的變化。與此同時，隨著菌體的增加，殘糖量將呈下降趨勢。產酸在4 h之前變化不大，在細胞生長趨于穩定期時，開始進行羧化，酸度增加速率大。在整個發酵過程中，在線電容值很好地描述了活細胞量的變化，為菌體生長控制和產物合成優化提供了條件。

圖3 用電容法、OUR和CER估計的比生長速率

圖4 黑曲霉發酵過程各種參數的變化

3 結論

本文以黑曲霉帶渣發酵生產檸檬酸的培養過程為對象，探討了用電容法在線活細胞量傳感器來解決這個難題的可能性。通過對儀器的分析條件進行優化，使其能夠不受培養基中水不溶性物質的影響。實驗結果表明，電容法活細胞量傳感器的電容值與活細胞量之間有著較好的線性對應關系，在相同實驗條件下數據的重復性較好。在比生長速率的估計中，在線電容法能準確地描述細胞生長狀態的變化。綜上所述，電容法在線活細胞量傳感器能夠準確測量出復合培養基中黑曲霉等可結團絲狀菌活細胞量，了解這類菌體的細胞生長代謝情況，從而為對其實施控制提供了較好的檢測手段。

［1］Arnold SA，Gaensakoo R，Harvey LM，et al.Use of atline and in-situ near-infrared spectroscopy tomonitor biomass in an industrial fed-batch Escherichia coli process［J］.Biotechnology and Bioengineering，2002，80:405 –413.

［2］Soley A，Lecina M，Gamez X.On-line monitoring of yeast cell growth by impedance spectroscopy［J］.Journal of Biotechnology，2005，118:398–405.

［3］Ferreira AP，Vieira LM，Cardoso JP，et al.Evaluation of a new annular capacitance probe for biomass monitoring in industrial pilot-scale fermentations［J］.Journal of Biotechnology，2005，116:403 –409.

［4］Xiong ZQ，Guo MJ，Guo YX.Real-Time Viable-Cell Mass Monitoring in High-Cell-Density Fed-Batch Glutathione Fermentation by Saccharomyces cerevisiae T65 in Industrial Complex Medium［J］.Jounal of Bioscience and Bioengineering，2008(4):409–413.

［5］Haack MB，Eliasson A，Olsson L.On-line cellmass monitoring of Saccharomyces cerevisiae cultivations by multiwavelength fluorescence［J］.Journal of Biotechnology，2004，114:199 –208.

［6］Neves AA，Pereira DA，Vieira LM，et al.Real time monitoring biomass concentration in Streptomyces clavuligerus cultivations with industrial media using a capacitance probe［J］.Journal of Biotechnology，2001，84:45 –52.

［7］Cannizzaro C，Gugerli R，Marison I，et al.On-line biomass monitoring of CHO perfusion culture withscanning dielectric spectroscopy［J］.Biotechnology and Bioengineering，2003，84:597–610.

Study on Online Capacitance Viable-Cell Mass Monitoring in Citric Acid Fermentation by Aspergillus niger in Complex Medium with Corn Dregs

Liu Yu-wei1，Huang Ming-zhi1，Zhou Yong2，Zhang Ji-xue2，Yang Ru-wen2，Feng Zhi-fei2，Chang Lei2，Zhao Qin-hu2
1(National Engineering Research Center for Biotechnology(Shanghai)，Shanghai 200237，China)2(Anhui BBCA Biochemical Co.Ltd，Bengbu 233010，China)

In this paper，cultivations of Aspergillus niger grown on an complex medium with corn dregs were performed.The feasibility of measuring online capacitance viable-cell mass of Fila-fungus grown on a complex medium was discussed.This study confirmed that the best measurement conditions were doubled frequency of 580 kHZ，10085 kHZ and low pass filter of 60.The result proved the relationship between capacitance and viable-cell mass with a correlation coefficient(R2)of 0.993 8.While complex medium with corn dregs was adopted，conventional off-line biomass determinations of several parameters，including DCW，optical density at 600nm wavelength(OD600)，packed mycelial volume(PMV)were performed throughout the bioprocess and then compared with on-line viable-cell concentrations measured using a capacitance probe.As a result，the best correlation coefficient(R2)is 0.907 2.During the same time frame，we compared the results determined by on-line indirect estimation methods including oxygen uptake rate(OUR)and carbon dioxide evolution rate(CER)，and reached at the conclusion that the specific growth rates estimated by on-line capacitance measurement could be more reliable during citric acid fermentation.Therefore，it is concluded that a capacitance probe is a practical tool for real-time viable biomass monitoring in a complex medium with corn dregs.

on-line viable-cell mass sensor，capacitance，Aspergillus niger，complex medium，corn dregs

碩士。

*國家“863”項目(2006AA02Z204)

2010－05－26，改回日期:2010－08－18