馬鈴薯蛋白質酶解制備多肽工藝優化

曹艷萍，楊秀利，薛成虎，代宏哲，賈懷亮

(1.榆林學院化學與化工學院，陜西 榆林 719000；2.濟南大學化學化工學院，山東 濟南 250022)

馬鈴薯蛋白質酶解制備多肽工藝優化

曹艷萍1，楊秀利2，薛成虎1，代宏哲1，賈懷亮1

(1.榆林學院化學與化工學院，陜西 榆林 719000；2.濟南大學化學化工學院，山東 濟南 250022)

以馬鈴薯蛋白質為原料，用蛋白酶催化水解制備多肽。以水解度(DH)為評定指標，考察各因素對水解度的影響。結果表明，中性蛋白酶為最佳蛋白酶，其他因素對馬鈴薯蛋白質水解度影響的順序為水解時間＞水解溫度＞加酶量＞馬鈴薯蛋白質質量分數。最佳工藝條件為馬鈴薯蛋白質質量分數8%、中性蛋白酶(pH7.0)加酶量5.0mg、溫度45℃、水解時間3h，水解度可達23.4%。

馬鈴薯蛋白質；蛋白酶；水解度；多肽

馬鈴薯營養價值很高，素有“地下蘋果”、“第二面包”、“植物之王”之稱[1-2]。馬鈴薯蛋白的必需氨基酸平衡優于其他植物蛋白，與全雞蛋和酪蛋白相當，其蛋白質的凈消化利用率(PER)可達到2.3[3]，維持人體氮平衡實驗證明馬鈴薯蛋白質優于其他作物蛋白質[4-5]。肽是參與體內代謝的重要物質，特別是那些具有特殊生理活性的功能肽近年來倍受關注[6]。馬鈴薯中約含3%的蛋白質[7-8]，可為人體提供大量的優質生物活性肽，達到醫療保健作用。Pihlanto等[9]用Alcalase、Neutrase和Esperase 3種蛋白酶水解馬鈴薯蛋白質，發現超濾后的水解產物對血管緊張素轉化酶有抑制作用。這種血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)是一種小分子活性肽，能清除超氧陰離子自由基、羥自由基等，可預防并治療癌癥、動脈粥樣硬化和糖尿病等疾病。本實驗對馬鈴薯蛋白質水解制備多肽的工藝條件進行研究，找出最佳酶解條件，旨在為馬鈴薯蛋白質的轉化利用及提高其附加值提供一條可行的途徑。

1 材料與試劑

1.1 材料、試劑與儀器

馬鈴薯蛋白質 內蒙卓資縣龍的馬鈴薯有限公司；牛血清白蛋白(標品) 上海源葉生物科技有限公司；甘氨酸(標品) 石家莊石興氨基酸有限公司；考馬斯亮藍G-250、酸性蛋白酶(pH2.5～4.0，酶活力60000U/g)、中性蛋白酶(pH6.8～8.0，酶活力50000U/g)、堿性蛋白酶(pH8.0～12.0，酶活力10000U/g)、茚三酮、果糖、12水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸、醋酸、醋酸鈉(試劑均為分析純)。

722S可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；80-2型電動離心機 江蘇金壇市環宇科學儀器廠；HH-S4A型電子恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；PHS-3C精密酸度計 上海理達儀器廠；LGJ-18C普通型冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠有限公司；H-2050R-1型冷凍離心機 青島廣青儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯蛋白質水解

稱取適量馬鈴薯蛋白質，加入一定量的緩沖液。加熱至所需溫度，恒溫20min，加入一定量的蛋白酶，水解一定時間后，滅酶(80℃水浴恒溫5min)，離心，上清液即為馬鈴薯蛋白質水解液。

1.2.2 水解度的測定

取一定量的馬鈴薯蛋白質水解液于試管中，加入一定量的蒸餾水、顯色劑，混勻定容后，置于沸水浴中加熱15min，同時作空白實驗。利用式(1)計算水解度[10-11]：

DH/%=[n/(6.25×N)]/5.1×100 (1)

式中：n為氨基含量/(μmol/mL)；N為蛋白質含量/(mg/mL)；5.1為每克馬鈴薯蛋白質的肽鍵毫摩爾數(mmol/g)[12]。

1.2.3 蛋白質含量的測定

采用考馬斯亮藍G-250法測定[13]。

1.2.4 氨基含量的測定

采用茚三酮法測定[14-15]。

1.2.5 水分的測定

采用直接干燥法，參照GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》。

1.2.6 灰分的測定

采用灼燒稱重法，參照GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》。

1.2.7 牛血清白蛋白的吸光度-質量濃度標準曲線繪制

稱取0.1000g牛血清白蛋白，溶于蒸餾水并定容至100mL，制成1000μg/mL牛血清白蛋白標準液，待用；稱取0.1000g考馬斯亮藍G-250，溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%的磷酸，然后用蒸餾水定容至1000mL，制成考馬斯亮藍溶液。

分別取牛血清白蛋白標準液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL，各加入考馬斯亮藍溶液5.00mL，分別用蒸餾水定容至10.00mL，制成分別含牛血清白蛋白0、20、40、60、80、100μg/mL的標準溶液，于595nm處測定吸光度。以牛血清白蛋白的質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.8 甘氨酸的吸光度-質量濃度標準曲線繪制

稱取0.1000g干燥過的甘氨酸溶解后定容至100mL，取出4.00mL定容至100mL得40μg/mL甘氨酸標準液，待用；稱取茚三酮0.5000g、果糖0.3000g、十二水合磷酸氫二鈉12.4000g、磷酸二氫鉀6.0000g，定容至100mL，制成茚三酮顯色劑。

分別取甘氨酸標準液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL，各加入茚三酮顯色劑1.00mL，40%乙醇定容至10mL，混勻放置15min后于570nm波長處測定吸光度。以甘氨酸的質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.9 單因素試驗

蛋白酶種類采用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶3種酶，馬鈴薯蛋白質質量分數采用3%、5%、8%、10%、12%五個水平，水解pH值采用3.6、6.5、7.0、8.0、9.0五個水平，水解時間采用2、3、4、5、6h五個水平，加酶量采用3.0、4.0、5.0、6.0、7.0五個水平，水解溫度采用35、40、45、50、55℃五個水平分別進行單因素試驗。

1.2.10 正交試驗

在單因數試驗基礎上，分別選擇馬鈴薯蛋白質質量分數、水解時間、蛋白酶加入量和水解溫度為考察因素，以水解度為考察指標，選用L9(34)正交表設計試驗。

2 結果與分析

2.1 牛血清白蛋白的吸光度標準曲線

以吸光度為縱坐標，牛血清白蛋白標準液的質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，見圖1。

圖1 牛血清白蛋白標準曲線Fig.1 Standard curve of bovine serum albumin

標準曲線的相關系數r=0.9989，線性范圍為0～100μg/mL，線性方程A=0.0025C+0.0017。

2.2 甘氨酸的吸光度標準曲線

圖2 甘氨酸標準曲線Fig.2 Standard curve of glycine

如圖2所示，標準曲線的相關系數r=0.9976，線性范圍在0～0.266μmol/mL，線性方程：A=0.0457C＋0.0116。

2.3 單因素試驗

分別考察蛋白酶種類、馬鈴薯蛋白質質量分數、水解pH值、水解時間、加酶量以及水解溫度對馬鈴薯蛋白質水解度的影響(每組數據重復做3次，取其平均值)。

2.3.1 蛋白酶種類的影響

選取馬鈴薯蛋白質質量分數8%、水解溫度40℃，分別加入5.0mg酸性蛋白酶(緩沖液pH3.6)、中性蛋白酶(緩沖液pH7.0)、堿性蛋白酶(緩沖液pH9.0)，水解2h，結果見表1。

表1 蛋白酶種類對水解度的影響Table 1 Effect of proteases on degree of hydrolysis of potato protein

由表1可知，中性蛋白酶對馬鈴薯蛋白質水解的催化效果最好。這可能是由于pH值的影響，中性條件有利于馬鈴薯蛋白質的水解。以下試驗均采用中性酶。

2.3.2 馬鈴薯蛋白質質量分數的影響

馬鈴薯蛋白質分別選取不同的質量分數，水解溫度采用40℃，加入5.0mg中性酶(緩沖液pH7.0)，水解2h，結果見圖3。

圖3 馬鈴薯蛋白質質量分數對水解度的影響Fig.3 Effect of potato protein concentration on its degree of hydrolysis

由圖3可知，馬鈴薯蛋白質的質量分數為10%時水解度最大。馬鈴薯蛋白質的質量分數小，水解速度慢，但是馬鈴薯蛋白質的質量分數過大，酶加入量相對較小，也不利于水解。所以選取馬鈴薯蛋白質的質量分數10%為宜。

2.3.3 pH值的影響

選取馬鈴薯蛋白質的質量分數10%，水解溫度采用40℃，加入5.0mg中性酶，分別采用pH3.6、6.5、7.0、8.0、9.0的緩沖液，水解2h，結果見圖4。

圖4 pH值對水解度的影響Fig.4 Effect of pH on degree of hydrolysis of potato protein

從圖4可以看出，pH6.5～8.0時，馬鈴薯蛋白質水解度相近，pH7.0時水解度最大，說明馬鈴薯蛋白質適宜在中性條件下水解。所以選取pH7.0為宜。

2.3.4 水解時間的影響

選取馬鈴薯蛋白質的質量分數10%，水解溫度采用40℃，加入5.0mg中性酶，采用pH7.0的緩沖液，水解不同時間，結果見圖5。

圖5 水解時間對水解度的影響Fig.5 Effect of hydrolysis duartion on degree of hydrolysis of potato protein

從圖5可看出，水解3h以后，馬鈴薯蛋白質水解度增加不明顯或降低，說明水解時間太長可能會引起一些副反應。所以水解時間選取3h為宜。

2.3.5 蛋白酶加入量的影響

圖6 中性蛋白酶加酶量對水解度的影響Fig.6 Effect of enzyme dose on degree of hydrolysis of potato protein

選取馬鈴薯蛋白質的質量分數10%，水解溫度采用40℃，加入不同量的中性蛋白酶，采用pH7.0的緩沖液，水解3h，結果見圖6。

從表6可以看出，隨著加酶量的增加，水解度增大，當加酶量超過5.0mg后，水解度不增反降。酶量過大，往往會導致反應太快而出現副反應。所以蛋白酶加入量應選擇5.0mg。

2.3.6 溫度的影響

選取馬鈴薯蛋白質的質量分數10%，在不同溫度下，加入5.0mg中性酶，采用pH7.0的緩沖液，水解3h，結果見圖7。

圖7 溫度對水解度的影響Fig.7 Effect of hydrolysis temperature on degree of hydrolysis of potato protein

從圖7可看出，水解溫度45℃時，水解度最大。適當提高水解溫度有利于水解，但是水解溫度過高，會造成酶失活而不利于水解。所以水解溫度45℃為宜。

2.4 正交設計試驗

表2 L9(34)正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels in the orthogonal array design

表3 L9(34)正交試驗設計及結果Table 3 Orthogonal array design arrangement and experimental results

根據單因素試驗結果，分別選擇馬鈴薯蛋白質質量分數、水解時間、蛋白酶加入量和水解溫度為考察因素，以水解度為考察指標，選用L9(34)正交表設計，因素、水平見表2，L9(34)正交試驗設計及結果見表3，方差分析見表4。

表4 方差分析Table 4 Variance analysis for degree of hydrolysis of potato protein with various hydrolysis conditions

由表3極差R大小可知，4個影響因素的主次順序為B＞D＞C＞A，即：水解時間＞水解溫度＞加酶量＞馬鈴薯蛋白質質量分數?？梢?，水解時間對水解度影響最大，其次是水解溫度，加酶量也有一定的影響，馬鈴薯蛋白質質量分數在所選水平范圍內對水解度影響很小。由表4可知，水解時間和水解溫度對水解度的影響顯著，加酶量對水解度的影響不顯著。在所選因素水平下，4種因素的最佳組合應為A1B2C2D2，在該組合的條件下馬鈴薯蛋白質水解度較高，為23.4%。

2.5 酶解產物多肽成分的理化指標

在上述最佳工藝條件下水解得到的水解液在15000 r/min離心10min后，取上清液凍干成粉。觀察其顏色、外觀及其溶解性并測定其常規成分。其產品為灰白色粉末，在水中極易溶解。產品總蛋白含量70.26%、灰分4.12%、水分4.97%。

3 結 論

馬鈴薯蛋白質水解制備多肽的最佳工藝條件為馬鈴薯蛋白質質量分數8%，加入5.0mg中性蛋白酶(緩沖溶液pH7.0)，在45℃溫度下水解3h，水解度可達23.4%。所得產品總蛋白含量70.26%、灰分4.12%、水分4.97%。

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Enzymatic Preparation of Polypeptides from Potato Protein

CAO Yan-ping1，YANG Xiu-li2，XUE Cheng-hu1，DAI Hong-zhe1，JIA Huai-liang1
(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Yulin University, Yulin 719000, China；2. School of Chemistry and Chemical Engineering, University of Jinan, Jinan 250022, China)

In this work, potato protein was used as the raw material to prepare polypeptides by enzymatic hydrolysis. The effects of four process conditions on the degree of hydrolysis of potato protein were explored. Neutral protease was the best choice for the hydrolysis of potato protein. Hydrolysis duration was found to be the most critical process condition, followed by hydrolysis temperature, enzyme dose and substrate concentration. The optimal values of the four process conditions were determined as follows: substrate concentration, 8%; hydrolysis temperature, 45 ℃; enzyme dose, 5.0 mg; and hydrolysis duration,3 h. The degree of hydrolysis of potato protein was as high as 23.4% under such hydrolysis conditions.

potato protein；protease；degree of hydrolysis；polypeptide

TS201.21

A

1002-6630(2010)20-0246-05

2010-06-27

陜西省教育廳資助項目(08JK507)

曹艷萍(1958—)，女，教授，本科，主要從事有機合成及天然物質應用方面的研究。E-mail：caoyp_0923@163.com