VC脂質體的制備與穩定性測定

楊水兵，劉成梅*，劉 偉，劉瑋琳，童桂鴻，章 瑜，鄭會娟

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

VC脂質體的制備與穩定性測定

楊水兵，劉成梅*，劉 偉，劉瑋琳，童桂鴻，章 瑜，鄭會娟

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

以卵磷脂和膽固醇為膜材，采用薄膜-超聲法制備VC脂質體。通過單因素考察生產工藝對包封率的影響以及正交設計法進行工藝優化。得出制備VC脂質體最佳工藝：制備溫度65℃、卵磷脂:膽固醇=5:1、總脂材:VC=25:1、總脂材:表面活性劑(吐溫-80)=10:2，在此條件下包封率可達42.1%，平均粒度為373.9nm；將脂質體在4℃下密閉放置15d，以脂質體的粒徑變化為指標考察其穩定性。結果表明，脂質體懸液粒徑無明顯變化，脂質體懸液穩定性良好。

VC；脂質體；薄膜水化法；包封率；穩定性

VC是一種水溶性的維生素，它可合成膠原蛋白和黏多糖，減少自由基對皮膚的損害，延緩衰老，還可抑制皮膚異常色素的沉積和酪氨酸酶的活性，減少黑色素的形成，被廣泛應用在美白和抗氧化護膚化妝品中[1-2]。人體對VC的全部需要量都由食物供給，食物中的VC可迅速被胃腸道吸收。但在某些特殊情況下，如腹瀉、腸手術、養料吸收障礙、胃腸炎、消化道潰瘍等情況下會使VC的吸收減少。VC性質不穩定，在儲藏和加工過程中受熱、見光易氧化、分解，導致其利用率顯著降低[3-4]。VC是水溶性的，不易滲透到皮膚角質層，故不能充分發揮效用。

為減少維生素的損失，提高其在人體中的吸收利用率，本研究將VC包裹在脂質體中，脂質體不同于普通的膏霜基質，它的結構類似生物膜，又稱人工生物膜，在水中平衡后具有親水性和疏水性兩性性質。它是以生物相容的磷脂和膽固醇為載體，將藥物溶解或包裹于脂質核，或是吸附、附著于納米粒表面的一種新型載藥系統，具有緩釋、控釋、提高藥物穩定性，增強療效降低毒副作用等方面的優越性，同時在生物體內及貯存過程中較穩定[5-6]。

脂質體常用的制備方法有薄膜法[7]、超聲法[8]、乙醇注入法[9]、高壓乳勻法等[10]。薄膜法制備的脂質體包封率較高，但一般粒徑較大。超聲法制備的脂質體粒徑較小，但其包封率低，且不穩定[11]。本實驗結合脂質體作為新型藥劑載體的優越性，以大豆卵磷脂和膽固醇作為膜材，采用薄膜-超聲法制備包封率高、穩定性好的VC脂質體，為VC脂質體的生產提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆磷脂(純度＞92%) 北京美亞斯磷脂技術有限公司；膽固醇 北京奧博星生物技術責任有限公司；VC、固藍B鹽 國藥集團化學試劑有限公司；吐溫-80 上海申字醫藥化工有限公司；EDTA 成都科龍化工試劑廠；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水乙醇、冰乙酸天津市大茂化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

RE-52C旋轉蒸發儀、SHE-Ⅲ型循環水真空泵 鞏義市予華儀器廠；KQ-50E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Nicomp380 ZLS超細微粒粒度分析儀美國Santa barbara公司；漩渦混勻器 廣州儀科實驗室技術有限公司；T6紫外-可見分光光度計 普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 VC脂質體的制備[12-13]

稱取一定比例大豆磷脂、膽固醇，置于250mL梨型瓶中；加入無水乙醇溶解，將梨形瓶置于65℃水浴中，在旋轉蒸發儀上減壓蒸發除去有機溶劑，待有機溶劑揮發完，形成脂質干膜后，關閉旋轉蒸發儀；加入含一定量VC及表面活性劑吐溫-80的PBS，在減壓的條件下旋轉洗膜15min，形成乳白色懸濁液；將乳白色懸濁液轉移至棕色容量瓶中，經過超聲處理即形成均勻的白色脂質體乳濁液。以包封率和粒徑為考察指標，篩選包封VC的最佳配方。

1.3.2 脂質體的粒徑測定[14-15]

將脂質體以緩沖液稀釋后，用激光納米粒度分析儀測定其粒徑及粒徑分布。測試角度90°，測試溫度為(25±0.1)℃，測試光波長為632.8nm。

1.3.3 脂質體包封率測定

1.3.3.1 VC標準曲線繪制

圖1 VC含量標準曲線圖Fig.1 Standard curve of vitamin C

精密吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0mL抗壞血酸標準使用溶液(相當于抗壞血酸0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0、150.0、200.0μg)，分別置于10mL比色管中。各加0.3mL EDTA溶液(0.25mol/L)、0.5mL乙酸溶液(0.5mol/L)、1.25mL固藍B鹽溶液(2g/L)，加水稀釋至刻度，用漩渦混勻器混勻。室溫(20～25℃)下放置20min后，移入1cm比色皿內，以零管為參比，于波長420nm處測量吸光度，以標準各點吸光度繪制標準曲線。

由圖1可知，在測定范圍內，吸光度(y)與溶液中VC含量(x)滿足線性關系，y=0.0078x－0.0110，R2=0.9986，相關性很高。

1.3.3.2 包封率測定(透析-分光光度法)

取脂質體懸浮液10mL置于已處理過的透析袋(cut off范圍12000～14000)中，封口，將其置于燒杯中，于室溫下透析10h。取出1mL透析內液，測定波長420nm處的吸光度，代入標準曲線計算出包封的VC含量，從而計算出VC的包封率[16]。

式中：m包、m總分別表示包封于脂質體的VC含量及總VC用量。

1.3.4 試驗設計

1.3.4.1 單因素試驗

分別以制備溫度、卵磷酯與膽固醇質量比(卵膽比)、表面活性劑(吐溫-80)用量、無水乙醇用量、VC與總脂材比為因素，考察各因素對脂質體包封率和粒徑的影響。1.3.4.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選取對脂質體包封率和粒徑影響較大的4個因素(VC含量、卵磷脂與膽固醇的比例、制備溫度以及表面活性劑加入量)，進行四因素三水平正交試驗設計。

2 結果與分析

2.1 最佳制備溫度的確定

圖2 制備溫度對包封率、粒徑的影響Fig.2 Effect of preparation temperature on encapsulation efficiency and particle size

在VC質量濃度2mg/mL、卵磷脂:膽固醇=4:1、卵磷脂:無水乙醇=2.5g/100mL、表面活性劑:總脂材=3:10、VC:總脂材=1:10(即卵磷脂1.6g、膽固醇0.4g、無水乙醇64mL、表面活性劑0.6g和VC 0.2g)條件下，考察制備溫度50、55、60、65、70℃對包封率及粒徑的影響，結果見圖2。

結合包封率和粒徑這兩個因素的變化，50～65℃之間包封率總體呈上升趨勢，而大于65℃則開始下降，粒徑隨溫度升高而增大，于60℃達到最大，超過60℃開始減小。雖然65℃粒徑不是最小值，但是其與最小值較接近，而且包封率為最大，故取65℃為制備溫度。脂質體的物理性質與介質溫度有密切關系，當升高溫度時脂質體雙分子層中疏水鏈可從有序排列變為無序排列，從而引起脂質膜物理性質的一系列變化，膜由“膠晶”態變為“液晶”態，其厚度減小、流動性增加等，發生這種轉變時的溫度稱為相變溫度。

在相變溫度以下時，膜結構處于晶態；在相變溫度以上時，處于流體態和液晶態。當發生相變時，可有液態、液晶態和晶態共存，出現相分離現象，使膜的通透性增加，被包裹物滲漏，故膜的流動性直接影響脂質體的穩定性。除此之外，過高溫度會造成VC的損失，而過低溫度成膜時間長且不均勻，故選取65℃為制備溫度。

2.2 卵膽比對包封率、粒徑的影響

在VC質量濃度2mg/mL、卵磷脂:膽固醇=4:1、卵磷脂:無水乙醇=2.5g/100mL、表面活性劑:總脂材=3:10、VC:總脂材=1:10和溫度65℃條件下，考察以卵磷脂:膽固醇為2:1、3:1、4:1、5:1、6:1制備VC脂質體，對其包封率、粒徑的影響，結果見圖3。

圖3 卵膽比對包封率、粒徑的影響Fig.3 Effect of phospholipids/cholesterol ratio on encapsulation efficiency and particle size

膽固醇對磷脂的相變具有雙向調節作用。在相變溫度以上時，它能抑制磷脂分子中脂肪酰鏈的旋轉異構化運動，降低膜的流動性；在相變溫度以下時，膜脂處于晶態排列，它又可誘發脂肪酰鏈的歪扭構象的產生，阻止晶態的出現。膽固醇分子中的羥基還可與磷脂分子中的羰基以氫鍵形成復合物。脂肪酰鏈自由運動的減少，引起膜的壓縮，面積減小，結合緊密，流動性降低而使滲透性降低。

而在一定比例范圍內，膽固醇比例越大，包封率越高，因為膽固醇表面活性劑作用使W/O乳液能穩定形成；但膽固醇比例過大時，組成脂質體的磷脂量太少，脂質體膜形成困難，而且不牢固，且由此形成的脂質體膜親水性太強，膜也容易破壞。綜上，并結合以上圖形可知，當卵磷脂:膽固醇小于5:1，包封率一直上升，于5:1達到最大，隨后開始呈下降趨勢。當卵磷脂:膽固醇=5:1時粒徑為最小值，大于此值時粒徑增大。故選取制備脂質體適宜的卵膽比為5:1。

2.3 表面活性劑與總脂材的比對包封率、粒徑的影響

在溫度65℃、卵磷脂:膽固醇=5:1、VC:總脂材=1:20條件下，固定其他組分的比例不變，只改變表面活性和總脂材的比例，制備VC脂質體，研究表面活性劑[17]對包封率的影響，結果見圖4。

圖4 表面活性劑與總脂材的比對包封率、粒徑的影響Fig.4 Effect of total lipid/surfactant ratio on encapsulation efficiency and particle size

聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯，吐溫-80是一種非離子型親水性表面活性劑，含親水性和疏水性的長鏈。脂質體中加入吐溫-80后，吐溫-80物理吸附于脂質雙層表面，其聚氧乙烯基從脂質雙層中伸出，致密覆蓋在雙層表面，形成有一定厚度的親水相。它屬于“立體屏障”型脂質體，比傳統脂質體更穩定。但是過多的加入其會造成脂質體的泄露，當表面活性劑:總脂材小于3:10時，包封率隨之增大而上升，超過其則下降，粒徑在其值小于3:10時一直下降，大于其則上升，所以取表面活性劑:總脂材=3:10為佳。

2.4 無水乙醇用量的確定

在溫度65℃、卵磷脂:膽固醇=5:1、VC:總脂材=1:20條件下，固定其他組分的比例不變，只改變卵磷脂和無水乙醇的比例，制備VC脂質體，研究乙醇用量對成膜、包封率及粒徑的影響，結果見圖5。

圖5 磷脂與無水乙醇用量比(g/100mL)對包封率及粒徑的影響Fig.5 Effect of phospholipids/alcohol ratio on encapsulation efficiency and particle size

無水乙醇作為成膜時的有機溶劑，對成膜均勻度，成膜好壞有最直接的影響，少量無水乙醇不能溶解磷脂，過多的無水乙醇則不易除去，均會影響到脂質體的均勻性，且由于其為有機溶劑，用量過多會造成試劑殘留。根據本試驗結果，在比例為2.5g/100mL時，包封率為最大值，粒徑為最小值，經試驗確定最后用量為2.5g/100mL為最佳。

2.5 VC與總脂材的比對包封率及粒徑的影響

在溫度65℃、卵磷脂:膽固醇=5:1條件下，固定其他組分的比例不變，只改變VC和總脂材的比例，制備VC脂質體，研究VC與總脂材的比[18](質量比)對包封率和粒徑的影響，結果見圖6。

圖6 總脂材與VC比對包封率及粒徑的影響Fig.6 Effect of total lipid/vitamin C ratio on encapsulation efficiency and particle size

VC與總脂材的比對脂質體的外觀和包封率影響也較大，隨著大豆卵磷脂比的增加，包封率增大，粒徑也同時增大，但是VC與總脂材的比過大則VC容易析出，不能制成較好的VC脂質體，包封率不高；比例過小制得的脂質體外觀不均勻，粒徑較大，且由于磷脂、膽固醇量較大造成絕對包封量少。綜合這兩方面因素，取總脂材:VC=20:1為制備比例。

2.6 VC脂質體正交試驗

通過正交設計確定VC脂質體配方。在前期實驗基礎上，確定了影響VC脂質體包封率主要因素：體系中VC的含量、卵磷脂與膽固醇的比例、制備溫度以及表面活性劑加入量。因此，用L9(34)表正交試驗設計法進行試驗(表1)，確定VC脂質體的最佳配方。

表1 VC脂質體正交試驗設計Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

按上述方法測定正交設計法中每個組處方制備出的脂質體中VC的含量。結果見表2。

表2 VC脂質體正交試驗結果及分析Table 2 Orthogonal array design arrangement and experimental results

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis for encapsulation efficiency with various preparation conditions

從表2和表3可以看出，影響因素主次順序為D＞C＞B＞A。最佳組合為A2B2C3D1，即溫度65℃、卵磷脂:膽固醇=5:1、總脂材: VC =25:1、表面活性劑:總脂材=2:10，此組合下得到的包封率可達42.1%。

2.7 脂質體的貯藏穩定性[19-20]

對按最優試驗組制備的脂質體懸液置于4℃下貯藏，并于不同時間(0、3、6、9、12、15d)取樣進行粒徑測定，結果見表4。最優試驗組：磷脂:膽固醇=5:1、總脂材: VC =25:1、表面活性劑:總脂材=2:10、制備溫度65℃，與正交分析最佳組合組相一致。

表4 貯藏穩定性試驗Table 4 Storage stability of vitamin C liposomes

由表4可知，脂質體儲藏時會隨著時間的延長造成絮凝結塊，而在冷藏條件下可延緩此變化，從粒徑出發考察了該脂質體在冷藏條件下的粒徑變化以得到其冷藏穩定性，結果發現粒徑在15d內變化不大，可說明脂質體的冷藏穩定性較好。

3 結 論

本實驗以卵磷脂、膽固醇為膜材，VC為芯材，采用單因素考察和正交設計對薄膜水化-超聲法進行了制備工藝的優化，得到的最佳工藝條件：制備溫度為65℃、卵磷脂:膽固醇=5:1、總脂材:VC=25:1、總脂材:表面活性劑=10:2，在此條件下脂質體包封率可達42.1%，平均粒度為373.9nm；且脂質體在4℃下貯藏，15d內具有良好的穩定性。

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Preparation and Stability of Vitamin C Liposomes

YANG Shui-bing，LIU Cheng-mei*，LIU Wei，LIU Wei-lin，TONG Gui-hong，ZHANG Yu，ZHENG Hui-juan
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Lecithin and cholesterol were used the membrane-forming materials to prepare vitamin C liposomes by thin film hydration-ultrasonic method. Based on single-factor experiments, the optimal preparation conditions for vitamin C liposomes were determined by orthogonal array design to be preparation temperature, 65 ℃; lecithin/cholesterolthe mass ratio, 5:1; total lipid/vitamin C mass ratio, 25:1; and total lipid/ surfactant mass ratio 10: 2. An encapsulation efficiency of vitamin C liposomes as high as 42.1% was achieved under these optimal preparation conditions, and the average particle size of the prepared vitamin C liposomes was 373.9 nm. The stability of vitamin C liposomes was investigated by evaluating the change of its average particle size during storage at 4 ℃ for 15 days. The average particle size of vitamin C liposomes had no significant change, suggesting excellent stability.

vitamin C；liposome；thin film hydration-ultrasonic method；encapsulation efficiency；stability

R944.1

A

1002-6630(2010)20-0230-05

2010-07-08

國家“863”計劃項目(2008AA10Z330)；國家重點實驗室目標導向項目(SKLF-MB-200808)作者簡介：楊水兵(1984—)，男，博士研究生，研究方向為食物(含生物質)資源的開發與利用。

E-mail：shuibingyang1984@126.com

*通信作者：劉成梅(1963—)，男，教授，博士，研究方向為食物(含生物質)資源的開發與利用。E-mail：chengmeiliu@yahoo.com.cn