殼聚糖-海藻酸鈉葉綠素亞鐵微膠囊的制備及緩釋性能研究

孟慶廷，陳萬東

(濟寧學院化學與化工系，山東 濟寧 273155)

殼聚糖-海藻酸鈉葉綠素亞鐵微膠囊的制備及緩釋性能研究

孟慶廷，陳萬東

(濟寧學院化學與化工系，山東 濟寧 273155)

用殼聚糖-海藻酸鈉微囊技術制備一系列葉綠素亞鐵微膠囊，以包封率和載藥量作為制備工藝優化指標，通過正交試驗得出最優方案。考察微膠囊在模擬胃液和模擬腸液中的控制釋放效果。結果顯示，制備該微膠囊的最優方案為海藻酸鈉15mg/mL、殼聚糖4mg/mL、氯化鈣20mg/mL、芯材與海藻酸鈉的質量比1:4。所得膠囊在模擬胃液和模擬腸液中緩釋性能良好。

殼聚糖-海藻酸鈉葉綠素亞鐵微膠囊；載藥量；包封率；緩釋

葉綠素亞鐵是一種具有補鐵保健功能的天然綠色色素，除了能夠用于鐵強化劑，治療缺鐵性貧血外，還可用作一些慢性病的輔助治療。葉綠素亞鐵具有抗菌、抗病毒、抗過敏和促進組織再生等作用，是一種良好的造血細胞復合劑，對各種原因引起的白細胞減少癥及各種貧血有治療作用[1]，其補鐵效果優于葉綠素鐵[2]。但葉綠素亞鐵的穩定性較差，尤其在光照、高溫等條件下[3-4]。微膠囊化可以減輕外界環境對敏感芯材的影響程度，增加易氧化、易揮發、光敏性和熱敏性物料的穩定性等，從而提高其儲存性能，改善可操作性[5-6]。殼聚糖和海藻酸鈉的生物相容性和降解性好，無毒副作用，是良好的藥物緩釋劑[7]。應用殼聚糖、海藻酸鈉為壁材制備微膠囊，所得產物的包封率高[8-9]，緩釋效果明顯[10]，并且可有效地增加芯材的可吸收性，降低芯材的副作用[11]。

本實驗利用殼聚糖和海藻酸鈉作材料，對制備葉綠素亞鐵微膠囊的工藝以及微膠囊在模擬胃液和模擬腸液中的緩釋性進行了研究，旨在為葉綠素亞鐵的研究與應用提供一些有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖(黏度35CPS，脫乙酰度92.8%)；海藻酸鈉(化學純)；葉綠素亞鐵(由大蒜葉自制，純度98.7%)；氯化鈣、氫氧化鈉、醋酸、濃鹽酸、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均為分析純；PBS(0.5mol/L，pH7.2)；胃蛋白酶(4000U/mg)、胰蛋白酶(2500U/mg) 上海東風生化試劑廠。

1.2 儀器與設備

723型可見分光光度計 上海精密科學儀器廠；DZF-6020型干燥箱 嘉興中新醫療儀器有限公司； PHSP1型精密pH計 上海大中分析儀器廠；SHZ-Q型水浴恒溫振蕩器 常州市偉嘉儀器制造有限公司；800型高速離心機 上海手術醫療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 制備工藝

稱取適量CaCl2，以1.0%乙酸溶解并稀釋成20mg/mL的CaCl2溶液。取適量殼聚糖，以上述氯化鈣溶液溶解，用0.10mol/L NaOH調節溶液pH值為5.5[12]。配制一定質量濃度的葉綠素亞鐵溶液，并以一定比例的海藻酸鈉溶于其中。取4mL葉綠素亞鐵的海藻酸鈉溶液，用帶8號針頭的5mL注射器緩慢滴至盛有20mL的殼聚糖氯化鈣溶液中，滴加高度20mm，滴完后靜置30min，過濾并用水洗滌3次，收集微球，真空干燥。

1.3.2 葉綠素亞鐵含量的測定

1.3.2.1 繪制標準曲線

產品的吸收曲線：配制一定質量濃度的葉綠素亞鐵鹽溶液，用分光光度計對產品進行掃描，在404nm和655nm波長處有兩處吸收峰。測定采用最大吸收峰404nm。

繪制標準曲線：以PBS溶液先配制質量濃度0.1000mg/mL標準母液，然后分別移取0、1、2、3、4、5mL分別放入25mL容量瓶中，用PBS液定容為0.00、4.00、8.00、12.00、16.00、20.00μg/mL標準系列溶液。以PBS溶液為參比，用分光光度計以1cm比色皿于404nm處分別測定吸光度。以葉綠素亞鐵質量濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪出吸光度-葉綠素亞鐵含量標準曲線(圖1)。

1.3.2.2 樣品葉綠素亞鐵總量測定

精確稱取葉綠素亞鐵微膠囊1.000g，溶于PBS緩沖溶液中，振蕩器上破碎12h，低溫高速離心以除去殼聚糖、海藻酸鈉和殘渣，取上層液，測定吸光度，對照標準曲線，求得葉綠素亞鐵的含量。

1.3.2.3 表面葉綠素亞鐵量測定

精確稱取0.5000g樣品，加入少量去離子水輕輕攪拌，洗去表面葉綠素亞鐵，離心分離，收集上層清液，重復該步驟2次，合并上清液，定容至50mL，過濾。測定方法同1.3.2.2節。

1.3.3 評估指數的選取

以包封率(encapsulated efficiency，EE)、載藥量(drug loading，DL)為指標綜合評價實驗結果以優化處方，評估指數(evaluating indicator，EI)為：

1.3.4 微膠囊的體外釋放實驗

1.3.4.1 在模擬胃液環境中的釋放

在50mL模擬胃液[13](200g NaCl、3.2g 胃蛋白酶、7.0mL濃鹽酸、雙蒸水定容于1000mL。pH值約為1.2)中加入一定量已干燥的膠囊，溫度37℃，轉速60r/min，在指定時間取樣，檢測葉綠素亞鐵含量，計算模擬胃液中釋放率。

1.3.4.2 在模擬腸液環境中的釋放

在上述胃液模擬液中處理一定時間的微膠囊，分離后水洗，加入50mL腸液模擬液[13](稱取6.8g KH2PO4溶于約500mL水中，另稱取l0g胰蛋白酶加水溶解，定容至1000mL，NaOH調節pH7.6)，溫度37℃，60r/min，在指定時間取樣，檢測葉綠素亞鐵含量，計算模擬腸液中釋放率。

2 結果與分析

2.1 葉綠素亞鐵鹽的標準曲線

測得葉綠素亞鐵含量(x)和吸光度(y)之間的關系如圖1所示，線性回歸方程為y=0.0816x－0.0004，R2=0.9997，線性較好，可用于葉綠素亞鐵的定量測定。

圖1 葉綠素亞鐵標準曲線Fig.1 Standard curve of sodium- iron(Ⅱ) chlorophyllin

2.2 海藻酸鈉質量濃度對微膠囊的影響

保持氯化鈣的質量濃度20mg/mL、殼聚糖質量濃度4mg/mL、葉綠素亞鐵:海藻酸鈉為1:4(m/m)，采用不同質量濃度的海藻酸鈉制備一系列微膠囊，結果見圖2。

圖2 海藻酸鈉質量濃度對包封率和載藥量的影響Fig.2 Effect of sodium alginate concentration on entrapment efficiency and drug loading

由圖2可知，當海藻酸鈉質量濃度小于20mg/mL時，微膠囊的載藥量和包封率隨著海藻酸鈉質量濃度的增大而增大，之后隨著海藻酸鈉質量濃度的增大而減小。這可能是由于海藻酸鈉質量濃度太低時，殼聚糖-海藻酸鈉聚電解質膜過薄，不能形成微球，或形成的微球機械強度低，不能有效地對芯材進行包埋；海藻酸鈉質量濃度過高，體系黏度大，包埋效果也不好[14]。

2.3 殼聚糖質量濃度對微膠囊的影響

保持海藻酸鈉質量濃度為15mg/mL、氯化鈣質量濃度為20mg/mL、芯材與海藻酸鈉質量之比為1:4不變，采用不同質量濃度的殼聚糖制備系列微膠囊，結果如圖3所示。

圖3 殼聚糖質量濃度對包封率和載藥量的影響Fig.3 Effect of chitosan concentration on entrapment efficiency and drug loading

從圖3可以看出，隨著殼聚糖質量濃度的增大，微膠囊的包封率和載藥量呈增加的趨勢，但當殼聚糖質量濃度超過4mg/mL時，包封率及載藥量反而有所下降。當殼聚糖質量濃度為4mg/mL時，微膠囊的包封率以及載藥量都達到最佳水平。

2.4 氯化鈣質量濃度對微膠囊的影響

保持殼聚糖的質量濃度4mg/mL、海藻酸鈉的質量濃度15mg/mL、芯材:海藻酸鈉為1:4，采用不同質量濃度氯化鈣制備一系列微膠囊，結果如圖4所示。

圖4 氯化鈣質量濃度對包封率和載藥量的影響Fig.4 Effect of CaCl2 concentration on entrapment efficiency and drug loading

由圖4可知，隨著氯化鈣質量濃度的增大包封率及載藥量均提高。但是，當氯化鈣質量濃度超過15mg/mL后，這兩個方面反而下降，這表明較高的氯化鈣質量濃度則會降低包封率和載藥量。這與Sezer 等[15]的研究結果一致。

2.5 芯材與海藻酸鈉的比例對微膠囊的影響

圖5 芯材壁材質量比對包封率和載藥量的影響Fig.5 Effect of core material/wall material ratio on entrapment efficiency and drug loading

保持其他條件不變，采用不同比例的葉綠素亞鐵與海藻酸鈉制備微膠囊，所得產物的結果如圖5所示。隨著海藻酸鈉與芯材質量比的增大，載藥率逐漸減小，包封率逐漸增大。海藻酸鈉與芯材比增大，一方面增強了微球對芯材的包封能力，使包封率增大，另一方面增加了微球的質量，故使載藥率下降。

2.6 正交試驗確定最佳條件

為了確定葉綠素亞鐵微膠囊制備的最佳條件，選取海藻酸鈉質量濃度、殼聚糖質量濃度、氯化鈣質量濃度、葉綠素亞鐵與海藻酸鈉質量比作為主要的考察因素，以微膠囊評估指數為考察指標進行正交試驗，結果見表1。

在4種因素中，對評估指數影響的程度大小為D＞A＞C＞B，綜合多種制備因素，選擇最佳微膠囊制備條件為A1B2C3D3，即海藻酸鈉質量濃度15mg/mL、殼聚糖質量濃度4mg/mL、氯化鈣質量濃度20mg/mL、芯材與海藻酸鈉質量之比為1:4。

表1 正交試驗結果Table 1 Orthogonal array design arrangement and experimental results

2.7 微膠囊的體外釋放實驗結果

在最優化條件下制備葉綠素亞鐵微膠囊，并在模擬胃液和模擬腸液環境中進行體外釋放實驗，在模擬腸液環境中的釋放情況是在模擬胃液環境中處理60min后進行的。結果見圖6、7。

圖6 葉綠素亞鐵微膠囊在模擬胃液中的釋放情況Fig.6 Time course of sustained release of chitosan-sodium alginate sodium-sodium ferrous chlorophyllin microcapsules in mimic gastric environment

圖7 葉綠素亞鐵微膠囊在模擬腸液環境中的釋放情況Fig.7 Time course of sustained release of chitosan-sodium alginate sodiumsodium ferrous chlorophyllin microcapsules in mimic intestinal environment

由圖6、7可見，在模擬胃液環境中停留60min后，微膠囊中芯材的釋放率即達32%。說明在酸性條件下，微膠囊表面的殼聚糖膜及殼聚糖與海藻酸鈉的復合膜易于遭到破壞，導致內容物釋放。在酸性溶液中停留時間越長，微膠囊的控釋能力越低。若在模擬胃液環境中處理60min后，在模擬腸液環境中120min累計釋放率可達60%。

3 結 論

殼聚糖性質穩定，具有良好的生物可降解性和相容性，毒性極小(LD50為16g/kg)。海藻酸鈉不僅是一種安全的食品添加劑，而且可作為仿生食品或療效食品的基材，它在腸道中能抑制有害金屬如鍶、鎘、鉛等在體內的積累[16]。殼聚糖與海藻酸鈉載體制備條件溫和，不需要有機溶劑，適合于有生物活性的蛋白質類藥物以及穩定性較差的芯材。殼聚糖與海藻酸鈉微囊法應用于葉綠素亞鐵的包封，其制備簡單快速，包封率好。制備的微囊在模擬胃液和模擬腸液中緩釋性能良好。正交試驗結果表明葉綠素亞鐵與海藻酸鈉的質量比對微膠囊的影響最大，制備微膠囊的最佳條件為海藻酸鈉質量濃度15mg/mL、殼聚糖質量濃度4mg/mL、氯化鈣質量濃度20mg/mL、葉綠素亞鐵與海藻酸鈉的質量比1:4。

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Preparation and Sustained-release Performance of Chitosan-Sodium Alginate Sodium-Sodium Ferrous Chlorophyllin Microcapsules

MENG Qing-ting，CHEN Wan-dong
(Department of Chemistry and Chemical Engineering, University of Jining, Jining 273155, China)

Sodium ferrous chlorophyllin was microencapsulated into chitosan-sodium alginate micropheres for the purpose of sustained release. The microencapsulation process for sodium ferrous chlorophyllin was optimized using orthogonal array design for achieving both higher entrapment efficiency and drug loading. Meanwhile, the sustained release of the prepared microcapsules in mimic gastric and intestinal environments was observed. The optimal microcapsule formula was found to be composed of 15 mg/mL sodium alginate, 4 mg/mL chitosan and 20 mg/L CaCl2 with a core material/wall material ratio of 1:4. The microcapsules obtained using this formula displayed good sustained-release performance in both mimic environments.

chitosan-sodium alginate sodium-sodium ferrous chlorophyllin microcapsules；drug loading；entrapment efficiency；sustained release

TS201.7；TQ20

A

1002-6630(2010)20-0137-04

2010-01-08

孟慶廷(1964－)，男，副教授，本科，主要從事天然產物功效成分的研發。E-mail：mqingting@163.com