蛋白酶預處理對玉米蛋白粉中葉黃素提取的影響

周海勝，蔣凌志，黃 梅*

(浙江大學化學工程與生物工程學系，浙江 杭州 310027)

蛋白酶預處理對玉米蛋白粉中葉黃素提取的影響

周海勝，蔣凌志，黃 梅*

(浙江大學化學工程與生物工程學系，浙江 杭州 310027)

選用玉米蛋白粉為原料，通過蛋白酶預處理再進行有機溶劑提取的方式制備葉黃素。與玉米蛋白粉中葉黃素的非酶解直接提取法相比，原料玉米蛋白粉采用最佳蛋白酶水解工藝預處理后(中性蛋白酶，酶用量為14000U/g玉米蛋白粉，液固比為20:1(mL/g)，溫度40℃，水解時間5h)，不但使葉黃素的提取量由非酶解直接提取的165.3μg/g提高到340.5μg/g，而且浸提時間由5h縮短為20min。

葉黃素；玉米蛋白粉；蛋白酶水解；提取

葉黃素(xanthophylls)又名“植物黃體素”，是一種“類胡蘿卜素”族物質，包括黃體素(lutein)、玉米黃質(zeaxanthin)與β-隱黃質(β-cryptoxanthin)等，分子結構如圖1所示[1]。葉黃素雖然不是VA前體，但對人體具有重要的生理功能。特別是在慢性疾病防治方面，黃體素和玉米黃質具有區別于其他類胡蘿卜素的特殊作用，如保護視力、預防心血管疾病和抗癌以及增強免疫力等[2-4]。

玉米蛋白粉(corn gluten meal，CGM)是生產玉米淀粉的副產物，長期以來主要作為廉價的畜禽飼料或隨廢液自然排放。據不完全統計，我國每年隨廢液自然排放的玉米蛋白粉在8萬t以上，不僅造成資源浪費，而且還會產生環境污染[5]。通過對玉米蛋白粉進行深加工處理得到天然葉黃素，能有效提高玉米和玉米蛋白粉的工業附加值，因此相關研究具有重要意義。

圖1 主要葉黃素的分子結構Fig.1 The molecular structures of xanthophylls

目前，從玉米蛋白粉中提取天然色素的方法主要是直接浸提法，采用70%～95%乙醇提取濃縮后得到葉黃素粗制品。由于直接浸提法只是將游離于蛋白粉顆粒表面的色素溶解，所以葉黃素的提取量普遍較低。選用蛋白酶水解以破壞蛋白質網狀結構、切斷葉黃素與其他組分的連接，應是增加葉黃素提取量的一種可行的方法，本實驗對此進行相關研究。另外，表征方面因采用HPLC法定量，通過使用YMC-C30類胡蘿卜素專用色譜柱大大提高了分析結果的準確性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米蛋白粉 河北省唐山市燕山玉米淀粉廠；黃體素標樣(質量分數90%) 上海華震科技有限公司；玉米黃質標樣(質量分數50%) 陜西森弗生物有限公司；中性蛋白酶、堿性蛋白酶 龐博生物工程有限公司；蜜蜂牌酸性蛋白酶 北京東華強盛生物技術有限公司；四氫呋喃、無水甲醇、無水乙醇、丙酮、無水乙醚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硼砂等均為AR級試劑，未純化直接使用。

1.2 儀器與設備

7821型磁力加熱攪拌器 江蘇省金壇市江南儀器廠；DHG29070A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海益恒實驗儀器有限公司；RE52299旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；DELTA320 pH計、電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；TDL80-2B離心機 上海安亭科學儀器廠；Evolution RC離心機 賽默飛世爾科技有限公司；Spectrumlab53-54紫外-可見分光光度計 上海棱光技術有限公司； Waters高效液相色譜儀(Waters 515高效液相色譜單元泵，Waters 2487雙波段紫外可見光檢測器，Waters 717 plus自動進樣器) 沃特世(Waters)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葉黃素標準溶液的配制

以四氫呋喃為溶劑配制成360μg/mL黃體素溶液、1034μg/mL玉米黃質溶液，使用時分別稀釋成系列質量濃度。以葉黃素質量濃度為例，稀釋成36、3.6、0.36、0.036μg/mL。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：YMC-Carotenoid液相色譜柱(C30，3μm，4.6mm×150mm)；流動相：甲醇:四氫呋喃:水=95:2:3(V/V)；流速1.0mL/min；進樣量：10μL；柱溫：30℃。

1.3.3 游離類胡蘿卜素總含量的測定

游離總類胡蘿卜素含量測定采用AACC(American Association of Cereal Chemist)法[6]。精確稱取3份1g左右玉米蛋白粉(精確到0.0002g)，各加入40mL水飽和正丁醇溶液，置于25℃恒溫振蕩箱內避光輕微振蕩3h(80r/min)，經布氏漏斗過濾得濾液，量取濾液體積。以水飽和正丁醇溶液為空白，用分光光度計在波長435.8nm處測定濾液的吸光度，再根據吸光系數計算每克玉米蛋白粉中游離的總類胡蘿卜素含量，3次平均即得最后結果。

式中：A為樣品吸光度；V為提取液體積/mL；為檢測波長下，質量分數為1%的溶液在光程1cm的比色皿中的吸光度(水飽和正丁醇中m為樣品質量/g。

游離黃體素與玉米黃質：由上述所得水飽和正丁醇濾液取樣進HPLC分析，用外標法計算游離的黃體素和玉米黃質的含量。

1.3.4 提取溶劑的選擇

取5g左右玉米蛋白粉置于100mL具塞錐形瓶中，分別加入50mL甲醇、乙醇、工業酒精、丙酮、二氯甲烷、四氫呋喃、正己烷、石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯和乙醚，避光提取6h，經布氏漏斗過濾得濾液，量取濾液體積后分別取樣進行HPLC分析，測定葉黃素的含量，并計算葉黃素提取量。

式中，葉黃素含量=黃體素含量+玉米黃質含量(其他葉黃素含量低，忽略不計)。

1.3.5 酶活力及剩余酶活力的測定

酶活力根據參考文獻采用福林法測定[7]。配制質量濃度25μg/mL的酶溶液250mL，放在40℃恒溫箱中，按時段取出1mL測酶活力，再與初始酶活力相比、取百分數，即可得剩余酶活力。

1.3.6 蛋白酶水解

稱取5.000g玉米蛋白粉置于250mL錐形瓶中，加入蛋白酶溶液，攪拌混勻，恒溫振蕩箱中水解指定時間，棄去上清液。再加入50mL無水甲醇避光提取0.5h，收集濾液并進行HPLC分析。

2 結果與分析

2.1 葉黃素標準曲線

經紫外-可見光分光光度計掃描，四氫呋喃溶液中黃體素和玉米黃質標準品的最大吸收波長為450nm，因此選擇液相色譜的檢測波長為450nm。圖2為黃體素和玉米黃質混合標樣的液相色譜圖。

黃體素和玉米黃質的混合標樣采用等強梯度洗脫，只需26min即可將黃體素和玉米黃質洗脫出來，兩者分離度為4.4。與一般類胡蘿卜素梯度洗脫的HPLC分析結果相比，不但達到基線分離且峰形對稱無明顯拖尾，表明該條件能進行黃體素和玉米黃質的有效分析。以峰面積-質量濃度作圖，得出黃體素和玉米黃質的標準曲線：黃體素，lgY=－4.97136+0.99699lgX，R=0.99998，最低檢測限(RSN=2)為0.0104μg/mL；玉米黃質，lgY=－4.46959＋0.97756lgX，R=0.99988，最低檢測限(RSN=2)為0.0395μg/mL。

圖2 葉黃素和玉米黃質標準品色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of lutein and zeaxanthin standards

圖3為原料玉米蛋白粉經有機溶劑直接(非酶解)提取濃縮液的色譜圖，可以看出產物中除黃體素和玉米黃質這兩種葉黃素外，還有其他類胡蘿卜素物質。2～5min對應的是極性較強的雜質，35min后出現的物質為胡蘿卜素等弱極性物質，如β-胡蘿卜素。由于β-隱黃質分子只有一個羥基，極性介于胡蘿卜素與玉米黃質之間，故推測保留時間為31min左右的是β-隱黃質[8]。通過計算可知，主要葉黃素質量濃度為黃體素95.8μg/mL、玉米黃質310.9μg/mL，即玉米蛋白粉中玉米黃質的含量是黃體素含量的3倍左右。

圖3 玉米蛋白粉提取樣品的色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of the extract from corn gluten meal

2.2 游離類胡蘿卜素的測定

通過AACC法測定，原料玉米蛋白粉中游離總類胡蘿卜素含量為228.3μg/g。由HPLC法測得原料玉米蛋白粉中游離葉黃素含量為203.6μg/g，其中，黃體素46.2μg/g，玉米黃質157.4μg/g，原料玉米蛋白粉中游離的葉黃素約占游離總類胡蘿卜素的89%。因為有機溶劑直接(非酶解)提取中葉黃素最大提取量為203.6μg/g，所以通過對原料的預處理，使部分處于絡合狀態的葉黃素游離出來，是進一步提高其提取量的有效途徑。

2.3 非酶解提取葉黃素

保持提取溫度25℃、提取時間6h和液固比10:1(mL/g)不變，考察不同溶劑對葉黃素直接提取效果的影響。如圖4所示，無水甲醇對葉黃素提取效果最好，提取量可達165.3μg/g，約占游離葉黃素總量的81.2%。其次是工業酒精、二氯甲烷和乙醇，葉黃素提取量分別為40.9、32.0、27.5μg/g；其他溶劑的提取效果相對較差，如丙酮、四氫呋喃、正己烷、石油醚、乙酸乙酯、乙醚等的葉黃素提取率分別只有11.8、11.8、3.5、3.3、5.9、8.6μg/g。

圖4 不同溶劑直接提取對葉黃素提取量的影響Fig.4 Effect of organic solvents on the direct extraction of xanthophylls without pre-treatment

不同有機溶劑的提取效果相差很大，與目標物的溶解度、分子極性、材料的親和性等因素有關[9-10]。甲醇和乙醇提取葉黃素效果最好，是因為甲醇和乙醇極性較強、親水性好的特點使它們更容易滲透到玉米蛋白粉顆粒內部，將大部分葉黃素溶解出來，故后續工藝中確定均以甲醇作為葉黃素的提取溶劑。

2.4 玉米蛋白粉酶解預處理工藝

2.4.1 蛋白酶的選擇

在40℃條件用福林法測定，酸性蛋白酶、中性蛋白酶和酶堿性蛋白酶活力分別為0.5、55.5、25.5萬U/g。

保持酶解溫度40℃、酶解時間5h不變，分別在酶用量11000U/g玉米蛋白粉，液固比20:1(mL/g)(條件1)；酶用量5500U/g玉米蛋白粉，液固比10:1(mL/g)(條件2)；酶用量5500U/g玉米蛋白粉，液固比20:1(mL/g)(條件3)3種不同情況下處理玉米蛋白粉，再以甲醇提取葉黃素，結果如圖5所示。

由圖5可知，所有實驗條件下經中性蛋白酶處理后提取葉黃素均能獲得最高的提取量，堿性蛋白酶次之，酸性蛋白酶最低，這與中性蛋白酶的活力最高、相同條件下水解玉米蛋白粉充分有關。此外，中性蛋白酶處理后葉黃素的提取量均高于非酶解甲醇直接提取的提取量(165.3μg/g)。而且在酶用量11000U/g玉米蛋白粉、液固比20:1(mL/g)的條件下，提取量超過了原料玉米蛋白粉中游離的葉黃素總含量(203.6μg/g)，達到了328.6μg/g，說明經中性蛋白酶酶解處理后，一部分絡合的葉黃素被釋放出來。而堿性蛋白酶和酸性蛋白酶預處理后葉黃素的提取量偏低，可能是由于葉黃素在酸堿環境中不穩定造成的，已有研究表明在酸性環境中，類胡蘿卜素容易發生由H+或路易斯酸親電試劑引發的加成反應而導致降解[11]。由此確定中性蛋白酶為玉米蛋白粉預處理的最佳蛋白酶。

條件1：酶用量11000U/g玉米蛋白粉，液固比20:1(mL/g)；條件2：酶用量5500U/g玉米蛋白粉，液固比10:1(mL/g)；條件3：酶用量5500U/g玉米蛋白粉，液固比20:1(mL/g)；水解時間和溫度均為5h、40℃。

2.4.2 酶解時間對葉黃素提取量的影響

圖6 酶解時間對葉黃素提取量的影響Fig.6 Effect of hydrolysis duration on extraction efficiency of xanthophylls

固定酶用量11000U/g玉米蛋白粉，溫度40℃，液固比20:1(mL/g)，控制酶解時間分別為0、1、2、3、5、7、9h。結果如圖6所示，可以看出酶解反應比較耗時，酶解1h內葉黃素的提取量變化不大，2～5h之間隨著時間增大提取量顯著增大，是酶解反應控制階段。5h后提取量不再顯著增加。測定40℃下中性蛋白酶剩余酶活力隨時間的變化(圖7)，可以看出5h時蛋白酶活力已不足初始活力的30%，造成5h后對玉米蛋白粉的水解效果變小。綜合考慮生產效率與葉黃素提取量，選取酶解時間為5h。

圖7 中性蛋白酶的穩定性Fig.7 Storage stability of the neutral protease used in this study

2.4.3 液固比對葉黃素提取量的影響

固定酶用量11000U/g玉米蛋白粉、酶解溫度40℃、酶解時間5h不變，分別以液固比5:1、10:1、15:1、20:1、30:1、40:1(mL/g)對原料玉米蛋白粉進行酶解反應，再用甲醇提取葉黃素后計算葉黃素提取量。由圖8可知，在液固比5～20mL/g范圍內時，隨著液固比加大，葉黃素提取量也隨之增大，這是由于在此范圍內加大液固比可以使酶分子和酶解產物更容易分散，從而加快了酶解速度[12]，相同時間內使更多的處于絡合狀態的葉黃素被釋放出來。當液固比增大到一定程度時，再增加液固比對酶解反應影響不大，反而會增加生產成本。當液固比為20:1(mL/g)時葉黃素提取為328.6μg/g，已接近最大值，因而選擇液固比為20:1(mL/g)。

圖8 液固比對葉黃素提取量的影響Fig.8 Effect of liquid/solid ratio on extraction efficiency of xanthophylls

2.4.4 酶解溫度對葉黃素提取量的影響

酶反應對溫度要求比較苛刻。固定酶用量11000U/g玉米蛋白粉、液固比20:1(mL/g)、以及酶解時間5h，考察酶的最佳反應溫度。30、40、50℃時處理玉米蛋白粉，所得葉黃素提取量分別為211.1、328.5、350.7μg/g。在30～50℃時，升高溫度能提高葉黃素的提取量，但環境溫度超過40℃就會對葉黃素的穩定性產生顯著影響[13]，而且過高的溫度會加速蛋白酶的失活，為了減少這兩方面的影響，選擇40℃作為酶解最佳溫度。結果如圖9所示。

圖9 酶解溫度對葉黃素提取量的影響Fig.9 Effect of hydrolysis temperature on extraction efficiency of xanthophylls

2.4.5 酶用量對葉黃素提取量的影響

固定液固比20:1(mL/g)、酶解溫度40℃、酶解時間5h，考察中性蛋白酶用量對葉黃素提取量的影響，結果如圖10所示。可以看出，在底物(玉米蛋白粉)濃度相同的條件下，酶用量在0～14000U/g玉米蛋白粉范圍內，隨著酶用量的增加相同時間內對等量的玉米蛋白粉的水解作用將增大，從而使葉黃素的提取量也隨之增大。當中性蛋白酶用量為14000U/g玉米蛋白粉時，葉黃素提取率達到了340.5μg/g，因此取14000U/g玉米蛋白粉作為中性蛋白酶的最佳用量。

圖10 酶用量對葉黃素提取量的影響Fig.10 Effect of enzyme load on extraction efficiency of xanthophylls

2.5 酶解與非酶解法提取葉黃素

分別取非酶解處理的樣品和經最佳酶解工藝處理過的樣品9個，其葉黃素提取量和萃取時間的關系如圖11所示。可以看出，非酶解處理的玉米蛋白粉經甲醇浸提，大約5h后葉黃素提取量達到最大值(165μg/g左右)；而經最佳酶解工藝處理過的玉米蛋白粉，只需20min即可獲得最大提取量(340μg/g左右)，提取效率獲得極大地提高。其原因之一是蛋白酶的水解作用破壞了蛋白質的網狀結構，使絡合的葉黃素呈游離態而進入提取液中，已有研究表明葉黃素(包括黃體素和玉米黃質)確實和蛋白質以復合物的形式存在于天然產物中[14-15]。原因之二是酶解作用使玉米蛋白粉顆粒尺寸變小，增大了固相的比表面積，液固萃取的傳質效率提高，以致葉黃素提取量比非酶解時提高將近一倍的同時提取時間大為降低。

圖11 蛋白酶水解對葉黃素浸提時間的影響Fig.11 Time courses of extraction efficiency of xanthophylls with and without proteolytic pre-treatment

3 結 論

結合AACC法，采用C30-HPLC測出原料玉米蛋白粉中的類胡蘿卜素主要為兩種葉黃素，游離葉黃素的含量大約為203.6μg/g。運用蛋白酶水解預處理玉米蛋白粉的方法提取葉黃素，其提取量可達340.5μg/g，比非酶解直接提取的165.3μg/g提高了106%，說明玉米蛋白粉中確實有一部分葉黃素與蛋白質等其他組分呈絡合狀態，直接有機溶劑提取無法將這部分葉黃素提取出來；而采用蛋白酶水解預處理原料的方式可以有效地將這一部分葉黃素釋放出來，從而極大地提高葉黃素的得率。

[1] LI H, TYNDALE S T, HEATH D D, et al. Determination of carotenoids and all-trans-retinol in fish eggs by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B,2005, 816: 49-56.

[2] 宋雁, 李寧. 葉黃素和玉米黃質與老年性黃斑變性[J]. 國外醫學: 衛生學分冊, 2008, 35(5): 292-295.

[3] 裴凌鵬, 惠伯棣. 玉米黃質改善D-半乳糖致衰老大鼠抗氧化功能的研究[J]. 老年醫學與保健, 2008, 14(4): 217-219.

[4] MARES-PERLMAN J A, MILLEN A E, FICEK T L, et al. The body of evidence to support a protective role for lutein and zeaxanthin in delaying chronic disease. Overview[J]. Journal of Nutrition, 2002, 132(3): 518-524.

[5] 郭冬生, 彭小蘭. 玉米蛋白粉的深加工與高F值寡肽的利用[J]. 畜牧獸醫雜志, 2009, 38(2): 41-43.

[6] PARK H, FLORES R A, JOHNSON L A. Preparation of fish feed ingredients: reduction of carotenoids in corn gluten meal[J]. Agricultural and Food Chemistry, 1997, 45: 2088-2092.

[7] 姜錫瑞. 酶制劑應用手冊[M]. 北京: 中國輕工業出版社, 1999: 292-299.

[8] LI Xiuxia, HAN Lujia. Effect of enzymatic treatment of corn gluten meal on lutein, zeaxanthin andβ-cryptoxanthin extraction[J]. Journal of Food Process Engineering, 2009, 32: 206-220.

[9] CRAFT N E, SOARES J H. Relative solubility, stability, and absorptivity of lutein and beta-carotene in organic solvents[J]. Agricultural and Food Chemistry, 1992, 40(3): 431-434.

[10] 盧艷杰, 龔院生, 姚惠源, 等. 玉米黃色素提取工藝的研究: 一[J]. 中國糧油學報, 2002, 17(2): 34-37.

[11] 惠伯棣. 類胡蘿卜素化學及生物化學[M]. 北京: 中國輕工業出版社,2005: 68-69.

[12] 李自升, 蔡木易, 易維學. 玉米蛋白粉的酶解工藝初探[J]. 食品與發酵工業, 2006, 32(4): 67-69.

[13] CHEN B H, YANG S H. An improved analytical method for the determination of carotenes and xanthophylls in dried plant materials and mixed feeds[J]. Food Chemistry, 1992, 44(1): 61-66.

[14] TAKAGI S, SHIROISHI M, TAKAHI T. Interaction of lutein with ovalbumin and other proteins: association and acquisition of novel optical activity[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1980, 44(9):2111-2117.

[15] HUEI-MEI C, MEYERS S P. Extraction of astraxanthin pigment from crawfish waste using a soy oil process[J]. Journal of Food Science, 1982,47: 892-900.

Effect of Proteolytic Pre-treatment on the Extraction of Xanthophylls from Corn Gluten Meal

ZHOU Hai-sheng，JIANG Ling-zhi，HUANG Mei*
(Department of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China)

After being pre-treated with protease, corn gluten meal

organic solvent extraction to obtain xanthophylls.Neutral protease was selected out of three commercially available proteases to pretreat corn gluten meal due to the highest extraction efficiency of xanthophylls, and methanol was found to be the best solvent for the extraction of xanthophylls among the ten solvents tested. The optimal conditions for neutral protease hydrolysis were determined to be: enzyme load, 14000 U/g substrate, liquid/solid ratio, 20:1; reaction temperature 40 ℃; and reaction duration, 5 h. Compared with direct extraction without proteolytic pre-treatment, the optimized neutral protease hydrolysis resulted in an increase of extraction efficiency of xanthophylls from 165.3 to 340.5 μg/g and a reduction of extraction duration from 5 hour to 20 min.

xanthophylls；corn gluten meal；proteolytic hydrolysis；extraction

TS202.3

A

1002-6630(2010)20-0052-06

2010-01-06

周海勝(1984—)，男，碩士研究生，主要從事天然產物分離研究。E-mail：20709327@zju.edu.cn

*通信作者：黃梅(1969—)，女，副教授，博士，主要從事天然產物分離和功能高分子材料合成研究。

E-mail：huangm@zju.edu.cn