氣相色譜微池電子捕獲檢測器測定蜂蠟中6種殺螨劑藥物殘留

陳 芳，李 丹， 張金振，黃京平，趙 靜，吳黎明,*

(1.中國農業科學院蜜蜂研究所，國家農產品加工中心蜂業分中心，北京 100093；2.北京城市學院生物醫藥系，北京 100083)

氣相色譜微池電子捕獲檢測器測定蜂蠟中6種殺螨劑藥物殘留

陳 芳1，李 丹2， 張金振1，黃京平1，趙 靜1，吳黎明1,*

(1.中國農業科學院蜜蜂研究所，國家農產品加工中心蜂業分中心，北京 100093；2.北京城市學院生物醫藥系，北京 100083)

建立一種準確、快速、簡便的蜂蠟中殺螨劑類藥物多殘留檢測技術。樣品經恒溫水浴液-液萃取、低溫冷凍離心凈化后用氣相色譜微池電子捕獲檢測器測定。對提取溶劑的種類、體積及提取次數進行研究。結果表明：30.0mL乙腈-正己烷(V/V，2:1)是最佳提取溶劑。經兩次冷凍及高速離心能將大部分的脂類基質去除。該方法的線性范圍為0.01～4mg/L，相關系數均大于0.9878。檢出限為0.96～4.69μg/kg，定量限為2.56～13.12μg/kg。該方法在3個不同濃度水平的添加均有很好的回收率(83.8%～110.4%)，相對標準偏差為1.70%～6.60%。

殺螨劑；蜂蠟；氣相色譜微池電子輔獲檢測器

Abstract：An accurate, fast and convenient method for simultaneous determination of 6 acaricide residues in beeswax by gas chromatography coupled with a micro-electron capture detector (GC-MECD) was established. The sample was saturated with hexane and acetonitrile in water bath with constant temperature. After frozen and centrifugation at 10000 r/min, the extract was analyzed by GC-MECD. Effects of extraction solvent, solvent volume and extraction times on extraction efficiency were explored. The best extraction solvent was 30.0 mL of acetonitrile-hexane (V∶V, 2:1). Twice freezing and high speed centrifugation could remove the interference of lipid matrix. This method exhibited an excellent linear relationship over the range of 0.01 to 4.0 mg/L with a correlation coefficient of larger than 0.9878. The limits of detection (LOD) for the 6 acaricides varied from 0.96 to 4.69 μ g/kg. The average recovery rates of these analytes spiked at three different levels ranged from 83.8% to110.4%, and the relative standard deviations (RSD) from 1.70% to 6.60%.

Key words：acaricide；beeswax；gas chromatography coupled with a micro-electron capture detector (GC-MECD)

蜂螨是蜜蜂的天敵，也是最為嚴重的敵害。螨害發生時，輕則群勢受損，重則全群覆滅。為防治蜂螨，溴螨酯、蠅毒磷、氟胺氰菊酯等殺螨劑已成為養蜂業廣泛施用的藥物。這幾種藥物的使用促進了養蜂業快速發展，但由于殺螨劑脂溶性特點，容易蓄積于蜂蠟中，蜂蠟的循環使用導致巢脾中藥物殘留種類、殘留量不斷增加，直接影響了蜂蠟質量安全。同時，通過蜜蜂與巢脾的接觸，殺螨劑藥物殘留能夠轉移至蜂蜜、蜂王漿、蜂膠等蜂產品中，進而造成蜂產品污染。

因此各種組織和各個國家紛紛制定殘留限量來應對蜂產品質量問題。美國規定雙甲脒在蜂蜜、蜂巢中的限量分別為1mg/kg和6mg/kg，蠅毒磷在蜂蜜、蜂巢中的限量分別為0.15、45mg/kg, 氟胺氰菊酯在蜂蜜中的限量為0.05mg/kg。澳大利亞規定氟胺氰戊菊酯、氟胺氰菊酯在蜂蜜中的限量為0.005、0.01mg/kg；日本規定了蜂蜜(包括蜂王漿)中雙甲脒、氯氰菊酯、氟胺氰菊酯暫定標準為0.2、0.01、0.05mg/kg[1-2]；其他國家及我國尚未制定。在檢測方法方面，國外對蜂蠟中農藥殘留研究主要為有機氯類、親脂性農藥及少數殺螨劑藥物等；國內對殺螨劑類藥物的研究主要集中于蜂蜜產品，先后制定了蜂蜜中雙甲脒及其代謝物、溴螨酯、4,4＇-二溴二苯甲酮及氟胺氰菊酯殘留量檢驗方法等6個標準，種類較為單一、有限。

由于國內、外使用的殺螨劑藥物的品種不同，建立適合我國國情的蜜蜂巢脾及蜂蠟中殺螨劑類藥物多殘留檢測方法十分必要。本研究擬建立一種快速、高效且具有普遍適用性的蜂蠟中常用殺螨劑多殘留檢測方法，為蜂產品質量安全監控提供有力的技術儲備和支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

溴螨酯、蠅毒磷、氟氯苯氰菊酯、氰戊菊酯、氟胺氰菊酯、溴氰菊酯標準品 美國Sigma公司；丙酮、乙腈、正己烷、甲醇、二氯甲烷(均為色譜級) 美國J.T.Baker公司；石油醚(分析純)。

1.2 儀器與設備

7890a-μECD 氣相色譜儀[配備7683自動進樣器，色譜柱為HP-5 (30m×0.25mm，0.25μm)] Agilent公司；旋轉蒸發儀 德國Heidolph公司；BCD-539WT冰箱 海爾公司；Himac-CR22GII高速冷凍離心機 日本Hitachi公司 。

1.3 標準儲備液的制備

取6種標準品適量，用正己烷溶解后，分別配制成100mg/L的標準儲備液，于－20℃冰箱中保存。分別取適量的6種標準品于同一容量瓶中，用正己烷定容為10mg/L的混合標準儲備液，于－20℃冰箱中保存。

1.4 蜂蠟樣品的制備

市售蜂蠟樣品，于－20℃冰箱中冷凍1h后粉碎，于－4℃冰箱中保存；巢蠟，以每100g蜂蠟加1L水的比例在大燒杯中煮沸后冷卻，將底部雜質用小刀削除，重復提純一次。制備好的純蜂蠟樣品如市售蜂蠟，冷凍后粉碎保存。

1.5 樣品提取與凈化

稱取1.0g蜂蠟樣品于50.0mL離心管中，加入20.0mL乙腈，在75℃水浴鍋中充分加熱溶解后，加入10.0mL正己烷充分搖勻。于－22℃冰箱內冷凍約45 mi n，10000r/min離心5min，取乙腈相于50.0mL離心管中，再次冷凍約45min，10000r/min離心5min，取上清液，旋轉蒸發至干，用1.0mL正己烷復溶，0.45μm濾膜過濾備用。

1.6 標準工作曲線的制備

取不含該實驗測定的6種殺螨劑殘留的蜂蠟樣品，按上述樣品提取與凈化方法制備好空白蜂蠟樣品，加入一定量的標準儲備液，配制成一定質量濃度梯度的標準曲線。

1.7 氣相色譜條件

進樣口：260℃，不分流進樣；檢測器：300℃；程序升溫：100℃恒溫1min，25℃/min升至200℃、恒溫1min，5℃/min升到260℃、恒溫5min，4℃/min升到300℃、恒溫4min；載氣：高純氮(＞99.999%)；流速：1.0mL/min；進樣體積：1.0μL。

2 結果與分析

2.1 提取和凈化條件的優化

文獻顯示，乙腈、甲醇和丙酮、正己烷、二氯甲烷、石油醚常作為蜂蠟殺螨劑類藥物殘留的提取溶劑[3-4]，因此本實驗對這6種溶劑的提取效率進行驗證。結果表明，乙腈、甲醇和丙酮均有滿意的提取效率(表1)，二氯甲烷和石油醚的提取效率偏低(19.2%～88.0%)，而正己烷只能提取出微量的氰戊菊酯、氟氨氰菊酯和溴螨酯。甲醇對氟氨氰菊酯和蠅毒磷的提取可能受基質的影響，回收率高達130%。為去除基質影響，在經提取的空白基質上添加標樣(標準加入法)，以此來消除基質干擾。校正后的結果顯示，乙腈、甲醇和丙酮均有更好的回收率(69.3%～119.4%)，尤其是氟氨氰菊酯和蠅毒磷的回收率從外標法中的130%、119.8%和124%分別變為119.4%、114.6%和94.9%，由此可見氟氨氰菊酯和蠅毒磷受基質影響最大。由于上述6種提取溶劑中，正己烷基本對目標化合物提取無效且又與乙腈或甲醇不互溶，本實驗將正己烷與乙腈或甲醇配比進行液-液分配提取研究其凈化效率。結果顯示，乙腈或甲醇與正己烷配比的提取溶劑具有很好的提取效率且有效地降低基質干擾，其中乙腈與正己烷配比的溶劑提取效率更高(表2)。因此，本實驗選擇乙腈和正己烷作為此方法的提取溶劑。

表1 6種溶劑不同定量方法的提取效率Table 1 Extraction rates of six kinds of solvents using different quantification methods

表2 兩種不同液-液提取溶劑提取效率比較Table 2 Comparison of extraction rates using two different solvent extraction methods

研究提取溶劑的體積和提取次數，5.0mL正己烷和10.0mL乙腈提取，能夠將除溴螨酯以外的其他5種藥物充分提取出來，且提取效率達到88.0%～126.0%， 而第1次溶劑提取中溴螨酯的提取效率僅達到了60%，且在第2次提取液中仍然提取到了少量的溴螨酯。在第3次提取液中沒有發現任何目標化合物。為了簡化提取步驟，同時比較兩次5.0mL正己烷和10.0mL乙腈提取與一次10.0mL正己烷和20.0mL乙腈提取，結果發現提取效率沒有差異。

由于蜂蠟的組成以烴類、脂類和醇類為主，低溫冷凍和高速離心的方法能將大部分的大分子脂類基質干擾物去除。因此，本實驗對冷凍次數進行研究。結果表明，經一次冷凍后，可以將大部分的脂類物質去除。二次冷凍離心后，離心液基本澄清，且色譜圖(圖1)顯示，目標化合物出峰時段內的干擾物更少。三次冷凍離心后，基本未見離心管壁上有脂類附著物，且色譜圖與二次冷凍離心后的差異不大。因此，本實驗選擇兩次冷凍離心作為凈化方法。從樣品的色譜圖上可知，經液-液提取、冷凍離心后的樣品基質雜質主要是一些小分子的極性物質，易氣化且出峰時間較早，對目標化合物基本不干擾，也不會因殘留在色譜柱中而污染色譜柱。因此，從實驗簡便易操作和實驗成本的角度考慮，本方法將不進一步采用固相萃取的方法對樣品進行凈化。

圖1 6種殺螨劑標準品氣相色譜圖Fig.1 GC-MECD chromatogram of six kinds of acaricide residues

2.2 方法學研究

2.2.1 方法的線性范圍和檢出限

表3 方法的線性、檢出限及定量限Table 3 Linear relationship and limit of detection (LOD) of the established method

殺螨劑是蜜蜂飼養過程中的常用藥物，由于大部分的殺螨劑是脂溶性的，易累積在巢脾中[5]。且國外的研究資料表明，蜂蠟中的殺螨劑殘留量通常在mg/kg的數量級上[6-7]。且各種組織和國家的殘留限量也表明，雙甲脒和蠅毒磷在蜂巢中的限量分別為6mg/kg和45mg/kg。本實驗在0.01～4mg/L范圍內選擇了0.01、0.1、0.5、1、

2、4mg/L 6個質量濃度，以峰面積為X軸、質量濃度為Y軸建立標準加入工作曲線(表3)。6種殺螨劑均有很好的線性。斜率范圍為3.92×10－5～10.5×10－5，截距為0.0013～0.0428，相關系數為0.9878。檢出限是在空白加標的基礎上測得的3倍信噪比對應的質量濃度，定量限為10倍信噪比對應質量濃度。結果顯示6種殺螨劑的檢出限為0.96～4.69μg/kg，其中氰戊菊酯的檢出限最低為0.96μg/kg，氟氯氰菊酯的檢出限最高。定量限為2.56～13.12μg/kg。

2.2.2 準確性和精密度

表4 不同質量濃度水平添加回收率及相對標準偏差(n=6)Table 4 Average recovery rates and relative standard deviations (RSD)of spiked samples with various concentration levels (n=6)

選擇3個不同質量濃度添加水平的回收率來驗證方法的準確性及精密度。結果顯示，3個質量濃度均有很好的回收率，尤其是在10μg/L(氟氯氰菊酯添加了20μg/L)的添加水平上，其回收率和相對標準偏差均略高于其他兩個水平的添加，分別為89.2%～110.4%、3.61%～6.60%(表 4)。

3 結 論

用20.0mL乙腈和10.0mL正己烷在75℃水浴溶解后的液-液提取，能夠快速、完全地將目標化合物提取出來。提取液在冷凍后經高速離心等凈化步驟，能夠有效地去除樣品基質中的脂類及其他大分子的干擾物質。方法學研究表明，本方法的定量限為2.56～13.12μg/kg，且在3個不同質量濃度添加水平上均取得很好的回收率。本方法具有快速、準確及試劑消耗少等特點。

[1] Food and Drug Administration of the United States. Pesticides tolerances[DB/OL]. http://www.cfsan.fda.gov.

[2] WTO/TBT-SPS Notification and Enquiry of China[DB/OL]. http://www.tbt-sps.gov.cn/foodsafe/xlbz/Pages/pesticide.aspx.

[5] FRIES I, WALLNER K, ROSENKRANZ P. Effects on varroa jacobsoni from acaricides in beeswax[J]. Apicult Res, 1998, 37(2):85-90.

[6] KAMEL A, AL-GHAMDI A. Determination of acaricide residues in saudi arabian honey and beeswax using solid phase extraction and gas chromatography[J]. Journal of Environmental Science and Health Part B, 2006, 41:159-165.

[7] KORTA E, BAKKALI A, BERRUETA L A, et al. Determination of amitraz and other acaricide residues in beeswax[J]. Analytica Chimica Acta, 2003, 475:97-103.

Determination of Six Acaricide Residues in Beeswax by Gas Chromatography Coupled with a Micro-electron Capture Detector

CHEN Fang1，LI Dan2，ZHANG Jin-zhen1，HUANG Jing-ping1，ZHAO Jing1，WU Li-ming1,*
(1. Apiculture Sub-Centers, National Agricultural Products Processing Center, Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China；2. Biological Medicine Department, Beijing City University, Beijing 100083, China)

TS207.53

A

1002-6630(2010)18-0244-04

2010-02-11

國家現代農業(蜂)產業技術體系建設專項(NYCYTX-43)

陳芳(1979—)，女，助理研究員，碩士，研究方向為蜂產品質量安全。E-mail：fangchen326@126.com

*通信作者：吳黎明(1973—)，男，副研究員，博士，研究方向為蜂產品質量安全。E-mail：apiswu@126.com