黃秋葵多糖組分對人體腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

任丹丹，陳 谷*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

黃秋葵多糖組分對人體腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

任丹丹，陳 谷*

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510640)

近年來多糖的抗腫瘤生物活性日益受到關(guān)注，本研究探討黃秋葵多糖對人體卵巢癌細(xì)胞(OVCAR-3)、乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、宮頸癌細(xì)胞(Hela)、胃腺癌細(xì)胞(MCG-803)增殖的抑制作用。通過水提醇沉提取黃秋葵粗多糖(raw polysaccharide，RPS)，經(jīng)DEAE-纖維素陰離子交換層析柱分離得到3種多糖洗脫組分E1、E2和E3；不同質(zhì)量濃度黃秋葵多糖作用于人體腫瘤細(xì)胞72h，采用MTT法對其抗癌活性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：RPS和E1組分可抑制OVCAR-3細(xì)胞的生長，隨質(zhì)量濃度的增加細(xì)胞存活率降低，呈劑量依賴關(guān)系，最低可分別降至72.30%和52.31%；E3組分可抑制MCF-7、Hela和MCG-803細(xì)胞的生長，抑制作用呈劑量依賴關(guān)系，細(xì)胞的存活率最低可分別降至63.90%、63.51%和67.71%。故而黃秋葵多糖組分可抑制多種腫瘤細(xì)胞生長，有開發(fā)成抗癌功能食品的前景。

黃秋葵；多糖；MT T；抗癌生物活性；功能食品

Abstract：The anticancer bioactivity of polysaccharide has gained more and more attention in recent years. Herein, the inhibitory effect of polysaccharides extracted from okra,Abelmoschus esculentus(L.) Moench, was investigated on different human cancer cell lines, OVCAR-3, MCF-7, Hela and MCG-803 cells. Raw polysaccharide (RPS) was extracted from fresh okra fruit by ethanol precipitation and further purified by DEAE anion exchange chromatography to obtain fractions E1, E2 and E3. These cancer cells were treated with different concentrations of okra polysaccharides for 72 h and their proliferation were analyzed by MTT assay. RPS and E1 had a significant inhibition effect on the proliferation of OVCAR-3 cells in a dose-dependent manner, and the lowest survival rates were 72.30% and 52.31%, respectively. E3 had an obvious inhibition effect on MCF-7, Hela and MCG-803 cells with the lowest survival rates of 63.90%, 63.51% and 67.71%, respectively. Therefore, these investigations are significance of exploring and developing okra as functional foods.

Key words：okra；polysaccharide；MTT assay；anticancer bioactivity；functional food

在中國中醫(yī)學(xué)自古就有“藥食同源”理論，食物與藥物同樣能夠防治疾病，且副作用小，這也是食物療法的基礎(chǔ)。據(jù)稱世界范圍內(nèi)30%～40%的癌癥可通過健康飲食得到預(yù)防[1]，在日常生活中多吃新鮮的水果和蔬菜在癌癥預(yù)防方面起著重要的作用。多糖作為天然生物大分子物質(zhì)，具有多種多樣的生物活性，如調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，提高機(jī)體免疫力，并在抗腫瘤方面發(fā)揮生物活性作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，云芝多糖[3]、香菇多糖[4-5]、靈芝多糖[6-7]、茶多糖[8]、蘋果多糖[9]等均能夠以某種形式抑制腫瘤細(xì)胞的生長。

黃秋葵[Abelmoschus esculentus(L.) Moench]又名補(bǔ)腎草、秋葵和羊角豆等，為錦葵科秋葵屬一年生草本植物?？晒┦秤玫哪酃糠殖錆M黏液，營養(yǎng)成分豐富，富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素、多糖、黃酮類化合物等，是一種營養(yǎng)保健蔬菜[10]，還可作為脂肪代替物制作低脂巧克力[11]。經(jīng)常食用可增強(qiáng)人體體質(zhì)，具有很高的開發(fā)價值和潛力。除此之外，實(shí)驗(yàn)證明黃秋葵的嫩果具有抗疲勞[12-13]、治療皮膚癌[14]等功能。

卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌和胃腺癌均為發(fā)病率高、嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤。目前，順鉑(cisplatin)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)等是臨床上預(yù)防和治療腫瘤的有效藥物，但因其毒副作用大而限制著這些藥物的長期使用，因此開發(fā)研制新的抗腫瘤活性物質(zhì)日益引起科研工作者的廣泛關(guān)注。本研究通過提取分離黃秋葵中的多糖，發(fā)現(xiàn)所得多糖組分對4種人體腫瘤細(xì)胞生長有抑制作用，為研制新的抗癌活性物質(zhì)和進(jìn)一步開發(fā)利用黃秋葵提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人體卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3、乳腺癌細(xì)胞MCF-7、宮頸癌細(xì)胞Hela和胃腺癌細(xì)胞MCG-803均從中山大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心購得。黃秋葵購于廣州蔬菜批發(fā)市場。

DMEM(低糖)培養(yǎng)基、新生胎牛血清 美國Gibco公司；噻唑蘭(MTT) Sigma公司；青-鏈霉素、0.25g/100mL胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO) 北京普博欣生物科技有限公司；DEAE-纖維素 上?？笊锛夹g(shù)有限公司；無水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、苯酚(重蒸)、濃硫酸、氯化鈉等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

潔凈工作臺 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；XDS-1R倒置顯微鏡 意大利Optika公司；CO2培養(yǎng)箱、冷凍干燥機(jī) 美國Thermo Electron公司；低速臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；Sunrise酶標(biāo)儀 奧地利Tecan公司；全自動高壓滅菌鍋 英國Astell公司；EYELA真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海愛朗儀器有限公司；臺式高速離心機(jī) 美國貝克曼公司；冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；HL-2B恒流泵、SBS-100數(shù)控計(jì)滴自動部份收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司；UV-2300紫外-可見分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)在含10%新生牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基(含100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)中，于37℃、5% CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，用0.25g/100mL胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 黃秋葵多糖的分離純化

黃秋葵粗多糖(RPS)的提取[15]，采用水提醇沉法：取新鮮黃秋葵嫩果，蒸餾水清洗干凈，搗碎加蒸餾水浸泡過夜，離心去除沉淀。上清液中加無水乙醇(乙醇的終體積分?jǐn)?shù)為45%)，靜置過夜，離心取醇沉淀，真空抽濾去除殘留的乙醇。加少量蒸餾水至提取物完全復(fù)溶，用分子截留量為6kD的透析袋于蒸餾水透析72h，真空濃縮，冷凍干燥，得黃秋葵粗多糖。

DEAE-纖維素經(jīng)堿酸堿預(yù)處理，用蒸餾水洗至中性。抽真空脫氣，裝入層析柱(3.0cm×18cm)，蒸餾水平衡過夜。黃秋葵粗多糖的分離[16]：稱取黃秋葵粗多糖，完全溶于去離子水中，過DEAE-纖維素層析柱，分別用去離子水、0.25mol/L PBS(pH6.0)、0.5mol/L PBS(pH6.0)、0.5mol/LNaOH溶液洗脫，收集洗脫液10mL/管。用苯酚-硫酸法快速檢測出含糖管，得洗脫曲線。收集同一洗脫峰的各含糖管，洗脫液經(jīng)過透析，真空濃縮，冷凍干燥，得黃秋葵多糖各洗脫組分，分別為E1、E2和 E3，－20℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)

經(jīng)黃秋葵多糖的分離純化得到4種黃秋葵多糖組分：RPS、E1、E2和E3。采用4種人體腫瘤細(xì)胞(OVCAR-3、MCF-7、Hela和MCG-803)的增殖抑制模型MTT法[17]，研究4種黃秋葵多糖對人體癌細(xì)胞的生長抑制作用，篩選有效組分。選取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用0.25g/100mL胰蛋白酶消化調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，以4×103個/孔接種于96孔板中，每孔補(bǔ)足完全培養(yǎng)基至200μL。另設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基的空白調(diào)零組。待細(xì)胞貼壁后，吸除舊培養(yǎng)液，加入不同質(zhì)量濃度黃秋葵多糖干預(yù)，質(zhì)量濃度分別為50、100、200、400、800μg/mL，每孔加藥量200μL，每個質(zhì)量濃度設(shè)置6個復(fù)孔。同時設(shè)一對照組，即加等量培養(yǎng)液(多糖質(zhì)量濃度0μg/mL)。于加藥72h后，每孔加入MTT(5mg/mL)溶液20μL，37℃繼續(xù)孵育4h。完全棄除孔內(nèi)上清液，每孔加入DMSO 200μL，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀檢測492nm波長處的吸光度(A492nm)。按照下式計(jì)算細(xì)胞存活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃秋葵多糖對人卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞增殖的抑制作用

不同質(zhì)量濃度黃秋葵RPS組分作用于OVCAR-3細(xì)胞72h后的A492nm及存活率如表1所示。2、3組與1組的吸光度相比，無顯著性差異；4、5、6組與1組的吸光度相比，有顯著性差異(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：RPS組分低質(zhì)量濃度時對OVCAR-3細(xì)胞生長無影響。當(dāng)質(zhì)量濃度升高至200μg/mL時，開始顯著地抑制細(xì)胞生長；當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到800μg/mL時，存活率最低可降至72.30%，且抑制作用呈劑量依賴關(guān)系。

表1 不同質(zhì)量濃度黃秋葵粗多糖對人卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞生長的抑制作用Table 1 Effects of different concentrations of RPS on proliferation of OVCAR-3 cells

表2 不同質(zhì)量濃度E1對人卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞生長的抑制作用Table 2 Effects of different concentrations of E1 on proliferation of OVCAR-3 cells

由表2可知，2組與1組的吸光度相比，無顯著性差異；3組與1組的吸光度相比，有顯著性差異(P＜0.05)；4、5、6組與1組的吸光度相比，差異極顯著(P＜0.01)。說明E1低質(zhì)量濃度組對OVCAR-3細(xì)胞的生長無影響，隨著質(zhì)量濃度的逐漸升高，抑制作用逐漸增強(qiáng)；當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到800μg/mL時，最低存活率為52.31%，且抑制作用呈劑量依賴關(guān)系。

另外兩種多糖組分E2和E3均未對OVCAR-3細(xì)胞顯示出抑制生長的作用。由此可見，對卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞而言，RPS和E1組分對其有顯著抑制生長的作用。

2.2 黃秋葵多糖對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用

表3 不同質(zhì)量濃度E3對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長的抑制作用Table 3 Effects of different concentrations of E3 on proliferation of MCF-7 cells

由表3可知，2、3、4、5、6組與1組的吸光度相比，有極顯著差異(P＜0.01)。說明與對照組相比，E3組分對MCF-7細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用。在200μg/mL時，細(xì)胞的存活率最低為63.90%。而數(shù)據(jù)顯示：RPS、E1和E2組分未對MCF-7細(xì)胞顯示出生長抑制作用。

2.3 黃秋葵多糖對人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的抑制作用

表4 不同質(zhì)量濃度E3對人宮頸癌Hela細(xì)胞生長的抑制作用Table 4 Effects of different concentrations of E3 on proliferation of Hela cells

由表4可知，2、3、4組與1組的吸光度相比，無顯著性差異；5、6組與1組的吸光度相比，差異極顯著(P＜0.01)。說明E3組分在低質(zhì)量濃度時對Hela細(xì)胞的生長無影響；當(dāng)質(zhì)量濃度增高至800μg/mL時，細(xì)胞存活率僅為63.51%。數(shù)據(jù)顯示：RPS、E1和E2組分未對Hela細(xì)胞顯示出生長抑制作用。

2.4 黃秋葵多糖對人胃腺癌細(xì)胞MCG-803增殖的抑制作用

表5 不同質(zhì)量濃度E3對人胃腺癌細(xì)胞MCG-803生長的抑制作用Table 5 Effects of different concentrations of E3 on proliferation of MCG-803 cells

由表5可知，2組與1組的吸光度相比，無顯著性差異；3組與1組的吸光度相比，差異顯著(P＜0.05)；4、5、6組與1組的吸光度相比，差異極顯著(P＜0.01)。說明E3低質(zhì)量濃度組對MCG-803細(xì)胞的生長無影響，隨著質(zhì)量濃度的逐漸升高，抑制作用逐漸增強(qiáng)，最低存活率為67.71%，抑制作用呈劑量依賴關(guān)系。數(shù)據(jù)顯示：RPS、E1和E2組分未對MCG-803細(xì)胞顯示出生長抑制作用。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)用水提醇沉法提取黃秋葵粗多糖，并將粗多糖經(jīng)DEAE-纖維素分級純化，得到3種不同的含糖組分E1、E2和E3。采用噻唑蘭MTT法分別檢測RPS、E1、E2和E3對4種人體腫瘤細(xì)胞(OVCAR-3、MCF-7、Hela、MCG-803)的生長抑制作用。研究結(jié)果顯示：對OVCAR-3細(xì)胞，RPS和E1組分可抑制其生長，細(xì)胞的存活率最低可分別降至72.30%和52.31%，且呈劑量依賴關(guān)系；而E2和E3組分未顯示抑制作用。另外，E3組分可抑制MCF-7、Hela和MCG-803細(xì)胞的生長，細(xì)胞的存活率最低可分別降至63.90%、63.51%和67.71%。結(jié)果表明，黃秋葵多糖組分RPS、E1和E3可對不同的人體腫瘤細(xì)胞特異性起抑制作用。

伍煥杰等[9]研究表明小分子改構(gòu)蘋果多糖對人結(jié)腸癌HT29細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用且能誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。呂俊等[17]研究表明銀耳多糖可誘導(dǎo)肝癌HepG-2細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞的增殖。銀耳多糖的主鏈結(jié)構(gòu)為甘露聚糖，支鏈由葡萄糖醛酸和木糖組成。朱勁華等[18]研究發(fā)現(xiàn)極大螺旋藻胞內(nèi)多糖可抑制SMMC7721腫瘤細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)SMMC7721細(xì)胞凋亡。極大螺旋藻胞內(nèi)多糖組成為鼠李糖、木糖、巖藻糖、甘露糖、半乳糖等。細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序死亡，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控，在腫瘤的生長過程中起著重要的作用。黃秋葵多糖的主要成分為葡萄糖醛酸、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖等[16]。因此推測黃秋葵多糖對人體腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用機(jī)理可能與其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)，但具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

目前，相對于動物實(shí)驗(yàn)存在費(fèi)用高、實(shí)驗(yàn)周期長和社會道德等問題，利用體外培養(yǎng)細(xì)胞篩選抗腫瘤藥物已成為非常重要的手段[19]。MTT法中，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可使噻唑蘭MTT還原為水不溶性的甲瓚(formazan)，并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。DMSO溶解甲瓚，測吸光度可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量，這是目前檢測細(xì)胞增殖與活性的常用方法，但是體外二維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)并不能完全模擬人體內(nèi)三維立體的環(huán)境。因此，我們正在建立介于二維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和復(fù)雜的動物模型之間的三維細(xì)胞培養(yǎng)模型，通過三維支持物擴(kuò)大細(xì)胞的生長空間，增加細(xì)胞數(shù)量和增強(qiáng)細(xì)胞間的相互依賴性，更真實(shí)的模擬體內(nèi)情況，實(shí)現(xiàn)快速高通量地篩選抑制腫瘤增殖的生物活性分子[19]。

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Inhibition Effect of Okra Polysaccharides on Proliferation of Human Cancer Cell Lines

REN Dan-dan，CHEN Gu*
(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

TS201.2

A

1002-6630(2010)21-0353-04

2010-03-17

任丹丹(1987—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樘穷愇镔|(zhì)及其藥物的制備與生物利用。E-mail：rendandan619@163.com

*通信作者：陳谷(1973—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)樘穷愇镔|(zhì)及其藥物的制備與生物利用。E-mail：chengu@scut.edu.cn