一株牛蒡根際纖維素降解芽孢菌的分離鑒定和發酵分析

侯進慧，蔡 侃，鄭寶剛，曹玉朋，葉 駿

(徐州工程學院食品(生物)工程學院，江蘇 徐州 221008)

一株牛蒡根際纖維素降解芽孢菌的分離鑒定和發酵分析

侯進慧，蔡 侃，鄭寶剛，曹玉朋，葉 駿

(徐州工程學院食品(生物)工程學院，江蘇 徐州 221008)

從牛蒡根際分離到一株纖維素降解菌株NP10。該菌是芽孢桿菌，其16S rDNA的Genbank序列號是FJ908093。分批發酵法對NP10進行的分析顯示，該菌是一株堿性纖維素降解菌。其濾紙酶(FPA)酶活力在32℃、pH8發酵48h達到最大為18.2U/mL，其羧甲基纖維素酶(CMCase)活力在32℃、pH7發酵36h達到最大，為8.1U/mL。

牛蒡；根際微生物；纖維素降解菌；芽孢桿菌

Abstract：In this study, a cellulose-degrading bacterium, NP10, was isolated from burdock (Arctium lappaL.) rhizosphere. NP10 was identified to belong to the family ofBacillussp. and its 16S rDNA Genbank accession number was FJ908093. Meanwhile,NP10 was identified as an alkaline cellulose-degrading strain through batch fermentation. A maximum filter paper activity of 18.2 U/mL was obtained after 48 h fermentation under the conditions of 32 ℃ and initial pH 8, and the optimal fermentation temperature and duration as well as initial pH were 32 ℃, 36 h and 7, respectively, for achieving a maximum carboxymethyl cellulose activity of 8.1 U/mL.

Key words：burdock；rhizosphere；cellulose-degrading strain；Bacillus

牛蒡(Arctium lappaL.)是兩年生草本植物，在分類上屬于菊科牛蒡屬。牛蒡的肉質根肥大，是一種可食用且營養價值較高的農產品，由于其具有抗菌、抑制腫瘤的作用，有著“東洋參”的美譽。江蘇省徐州市豐縣是我國牛蒡的主要產區，牛蒡種植面積達到全國總面積的40%以上[1]，其牛蒡產品出口到日本、韓國等地區，經濟效益較高。人們對牛蒡的研究很多都著眼于營養、食用和藥理等方面，而與牛蒡產量息息相關的微生態系統特別是根際土壤微生物的研究卻未見報道[2-4]。根際土壤微生物數目眾多，種類也因植株而有較大差別，對其分析不僅可了解根際微生物與植株生長的關系，而且可以開發出新型菌種資源。

纖維素是自然界中分布廣泛且產量最豐富的一種碳水化合物資源，但是由于降解困難，導致纖維素資源的利用率非常的低。比如秸稈和皮殼等原料大部分都被焚燒掉，這樣做既危害生態平衡，又加重環境污染。纖維素分子可被纖維素酶降解。纖維素酶是一個酶系，能降解β-1,4-葡萄糖苷鍵。纖維素酶的研究是纖維素資源綜合利用的基礎。同時，纖維素酶也可以應用于牛蒡等農產品資源的開發利用。植物的根莖有著大量的纖維物質，而纖維物質的降解，對于提取植物抑菌、抗癌、抗衰老等有效成分有著重要的意義。因此，開發新型纖維素酶對于解決食品短缺、環境污染和能源危機等問題都有著一定的現實意義。

在纖維素降解研究中，人們對于真菌纖維素酶的研究較多，而對細菌纖維素酶的報道較少[5]。因此，需要通過生物工程方法加大對細菌纖維素酶的研究，以開發出特性各異的纖維素酶。本實驗室在對牛蒡根際微生物的分析中，篩選到一株具有較高纖維素降解活性的菌株NP10，對其進行初步鑒定和酶學分析。

1 材料與方法

1.1 菌種

在兩年中，從徐州豐縣牛蒡產區的不同生長點隨機取樣，采集多株牛蒡，并與根際土壤一同帶回實驗室，完成菌株分離工作。

1.2 試劑

羧甲基纖維素、蛋白胨、酵母膏等分析純 國藥集團化學試劑有限公司；用于PCR反應和電泳檢測的分子生物學試劑分別購自上海生工生物工程技術服務有限公司和天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 培養基

用于菌株分離的初篩液體培養基(g/L)：蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10、滅菌備用。固體培養基還需加瓊脂粉12g/L，高壓滅菌備用。產纖維素酶菌株篩選培養基(g)：羧甲基纖維素10、蛋白胨10、酵母膏5、KH2PO41、MgSO40.2、NaCl 10、葡萄糖2、瓊脂12，去離子水定溶至1L，滅菌備用。發酵培養基(g)：羧甲基纖維素10、蛋白胨10、酵母膏1、去離子水定溶至1L，滅菌備用。

1.4 菌株分離與純化

分別將5g牛蒡根際土壤樣品加入50mL LB培養基中，在250mL錐形瓶中，以160r/min轉速于25℃培養24h。取富集后的培養液進行梯度稀釋，涂布于LB培養基，培養長出菌落后，再將菌落轉接到產纖維素酶菌株篩選培養基，于培養溫箱中培養2～4d，然后將質量濃度為0.5g/100mL的剛果紅倒入培養基中染色5min，倒掉剛果紅后，使用質量濃度為5g/100mL的NaCl溶液浸泡脫色1h[6]。若菌株周圍有透明水解圈出現，則說明該菌株產纖維素酶。纖維素酶可以將培養基中的羧甲基纖維素水解為小分子質量的低聚糖、二糖或單糖，剛果紅與羧甲基纖維素結合后顯紅色，而與小分子質量糖類結合不顯紅色，因此產纖維素酶菌株周圍出現透明水解圈。對初篩到的菌株進行劃單菌落復篩。對產纖維素酶菌株進行培養，測量透明水解圈與菌落直徑的比值初步確定產纖維素酶活性高的菌株。

1.5 菌落形態觀察和生理生化特征分析

在固體培養基上觀察菌落特征，對細菌進行革蘭氏染色和芽孢染色觀察，并進行菌落生理生化特征分析[7-8]。

1.6 基因組DNA提取和16S rDNA序列分析

提取菌株NP10基因組DNA[9]，作為PCR反應模板。使用細菌通用引物[10]：F：5＇-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3＇，R：5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇，擴增獲得菌株16S rDNA序列。PCR反應體系(50μL)：10×PCR反應緩沖液5μL，dNTP 4μL，上、下游引物各1μL，模板DNA 1μL，TaqDNA 聚合酶0.5 μL，加無菌超純水補足體積。反應程序是：95℃預變性5min；95℃變性30s，54℃退火60s，72℃延伸90s，30個循環；72℃延伸10min。將獲得的16S rDNA 片斷送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。用BLAST程序在GenBank基因庫中將獲得的16S rDNA序列進行序列比對，分析菌株分類地位。

1.7 纖維素酶活性發酵分析

采用分批發酵法培養菌株NP10，將種子培養液按2%接種量轉接至含有50mL發酵培養基的250mL 錐形瓶中，進行發酵培養。發酵培養一定時間后，取出50mL發酵液，4000r/min離心10min，取上清作為粗酶液測定其酶活力。分析該菌產濾紙酶(FPA)、羧甲基纖維素酶(CMCase)的最適發酵pH值、溫度和時間[11-12]。

2 結果與分析

2.1 產纖維素酶菌株的篩選

圖1 菌株NP10產生的透明水解圈Fig.1 Transparent hydrolysis circle of NP10

如圖1所示，通過剛果紅染色法從牛蒡根際篩選到多株產纖維素酶菌株，其中菌株NP10產纖維素酶活性較高。

2.2 菌株NP10的鑒定

表1 菌株NP10生理生化特性分析結果Table 1 Physical and biochemical analyses of strain NP10

菌株NP10的菌落呈圓形、淺黃色、粗糙、不透明、邊緣有皺褶。革蘭氏染色呈陽性，芽孢染色觀察可見有芽孢形成。菌株NP10的生理生化分析結果見表1。實驗獲得1419bp的16S rDNA序列，分析顯示菌株NP10與Genbank中的Bacillus subtilissubsp. subtilis str.168序列相似性最高，達到100%，其Genbank序列號是FJ908093。菌株NP10與芽孢桿菌菌株的比對結果見圖2。綜合菌落形態觀察、生理生化分析和16S rDNA序列特征等結果，確定菌株NP10是Bacillussp.。

圖2 菌株NP10的16S rDNA序列分析結果Fig.2 Sequence analysis of NP10

2.3 pH值對菌株NP10產酶的影響

圖3 pH值對菌株NP10產酶的影響Fig.3 Effect of pH on enzyme activity produced by NP10 fermentation

通過改變培養基的pH值，分析菌株NP10的產酶情況。如圖3所示，在培養基pH值為7時，CMCase活性達到最大，在pH值為6和8時降到50%以下，在pH值小于5或大于9時則幾乎檢測不到酶活力。FPA活力在培養基pH8時達到最大，在pH5～10之間都有一定的活性。

2.4 溫度對菌株NP10產酶的影響

圖4 溫度對菌株NP10產酶的影響Fig.4 Effect of temperature on enzyme activity produced by NP10 fermentation

通過改變分批發酵過程中的培養溫度，分析菌株NP10產酶情況。如圖4所示，在發酵溫度為32℃時，CMCase和FPA的活力均達到最大。在27℃到37℃之間時，FPA活力變化較大，而CMCase活力在這個溫度范圍內活力都比較高，變化較小。

2.5 培養時間對菌株NP10產酶的影響

圖5 培養時間對菌株NP10產酶的影響Fig.5 Effect of cultivation time on enzyme activity produced by NP10 fermentation

通過在分批發酵過程中定時分析CMCase和FPA的活性，研究兩種酶的活性變化。如圖5所示，NP10在32℃、pH8時，分批發酵48h左右其FPA活力達到最大，是18.2U/mL；在32℃、pH7時，分批發酵36h其CMCase活力達到最大，為8.1U/mL。

3 討 論

本實驗在對牛蒡根際可培養微生物分析中發現了一株產纖維素酶活性較高的細菌，對其進行了鑒定和發酵分析。實驗獲得了菌株NP10長度1419bp的序列，結合菌落特征和生理生化分析結果，初步鑒定此菌株是Bacillussp.。對NP10進行的發酵分析顯示，該菌是一株堿性纖維素酶產生菌。在32℃ pH8時，分批發酵48h，其FPA活性達到最大值18.2U/mL；在32℃pH7時，分批發酵36h，其CMCase活力達到最大值8.1U/mL。

在纖維素酶活性分析中，目前常用的檢測方法是FPA和CMCase活性測定法。其中，FPA活性測定的底物是濾紙，其活性分析的是3類纖維素酶協同作用的效果，可以顯示出發酵液總的酶活力。而CMCase活性測定法主要說明的是內切β-葡萄糖苷酶的活力，對于纖維素降解應用有重要的價值。與文獻相比，本實驗菌株NP10的CMCase活性較高[13-14]。有研究者分析一株產堿性纖維素酶的假諾卡氏菌屬(Prauseria)放線菌，液體發酵顯示其CMCase酶活力達7.64U/mL，在經過紫外誘變后活力達到17.59U/mL[14]。課題組將對菌株NP10進行誘變育種，提高其CMCase酶活力。

[1] 高明俠, 苗敬芝, 曹澤虹, 等. 雙酶法提取牛蒡多糖的研究[J]. 食品科學, 2008, 29(9):260-263.

[2] MARUTA Y, KAWABATA J, NIKI R. Antioxidative caffeoylquinic acid derivatives in the roots of burdock (Arctium lappaL.)[J]. J Agric Food Chem, 1995, 43(10):2592-2595.

[3] KNIPPING K, ELISABETH C E, WIJERING S C, et al.In vitroandin vivoanti-allergic effects ofArctium lappaL.[J]. Exp Biol Med, 2008,233:1469-1477.

[4] KARDOSOVA A, EBRINGEROVA A, ALFOLDI J, et al. A biologically active fructan from the roots ofArctium lappaL. var. Herkules[J]. Int J Biol Macromol, 2003, 33:135-140.

[5] 徐建. 中性纖維素酶菌株的選育及強分解纖維素細菌1.1002分類地位的確立[D]. 沈陽:沈陽農業大學, 2000.

[6] 齊云, 陳飛, 袁月祥, 等. 一株能分解纖維素的高溫耐堿放線菌[J].應用與環境生物學報, 2003, 9(3):322-325.

[7] 布坎南R E, 吉本斯N E. 伯杰細菌鑒定手冊[M]. 北京:科學出版社,1984.

[8] 東秀珠, 蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京:科學出版社, 2001.

[9] SYN C K C, SWARUP S. A scalable protocol for the isolation of largesized genomic DNA within an hour from several bacteria[J]. Analytical Biochemistry, 2000, 278:86-90.

[10] 焦振泉, 劉秀梅, 孟昭赫. 16S rRNA序列同源性分析與細菌系統分類鑒定[J]. 國外醫學:衛生學分冊, 1998, 25(1):12-16.

[11] BHAT M K, BHAT S. Cellulose degrading enzymes and their potential industrial applications[J]. Biotechnology Advance, 1997, 15:583-620.

[12] 陳電容. 生物化學與生化藥品試驗[M]. 北京:化學工業出版社, 2007:68-69.

[13] 魏亞琴, 李紅玉. 纖維素酶高產菌選育研究進展及未來趨勢[J]. 蘭州大學學報:自然科學版, 2008, 44(7):107-115.

[14] 侯曉娟. 堿性纖維素酶產生菌的分離、選育、發酵產酶條件及酶學性質研究[D]. 西安:西北大學, 2008.

Isolation, Identification and Fermentation Analysis of a Cellulose-degrading Bacterium fromArctium lappaL. Rhizosphere

HOU Jin-hui，CAI Kan，ZHENG Bao-gang，CAO Yu-peng，YE Jun
(Food Engineering (Bioengineering) Department, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

TS201.3

A

1002-6630(2010)21-0312-04

2010-07-01

徐州市科技計劃項目(XZZD0924)；徐州工程學院引進人才科研啟動項目；徐州工程學院青年重點科研項目(XKY2008110)；江蘇省大學生實踐創新計劃項目(2010-971)

侯進慧(1980—)，男，講師，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：houjinhui0@126.com